[发明专利]一种表达faeG的基因工程益生菌的构建方法及用途无效

专利信息
申请号: 201010256198.1 申请日: 2010-08-17
公开(公告)号: CN102031262A 公开(公告)日: 2011-04-27
发明(设计)人: 徐子伟;刘淑杰;李永明;王一成 申请(专利权)人: 浙江省农业科学院
主分类号: C12N15/31 分类号: C12N15/31;C12N15/63;C12N1/21;A61K39/108;A61P1/12;A61P31/04;C12R1/46;C12R1/225
代理公司: 杭州求是专利事务所有限公司 33200 代理人: 周烽
地址: 310021 *** 国省代码: 浙江;33
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摘要: 发明公开了一种表达faeG的基因工程益生菌的构建方法及用途,根据已公开的F4大肠杆菌菌毛粘附素FaeG的基因序列及表达载体质粒特点,设计含特异酶切位点的引物;以产肠毒素性大肠杆菌质粒DNA为模板,进行PCR扩增,获得含有faeG基因的片段,将其与表达载体质粒pNZ8148进行连接,获得重组质粒pNZ8148-faeG,通过电转化方法将该重组质粒转入乳杆菌或乳球菌细胞内,得到表达产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌,在乳链菌肽(nisin)的诱导下进行表达,并经SDS-PAGE和Western blot分析证明目的基因得到正确表达。该重组菌可用于预防哺乳仔猪和断奶仔猪大肠杆菌性腹泻。
搜索关键词: 一种 表达 faeg 基因工程 益生菌 构建 方法 用途
【主权项】:
一种表达faeG的基因工程益生菌的构建方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:(1)获得大肠杆菌粘附素FaeG基因:以产肠毒素性大肠杆菌C83907质粒DNA为模板,设计合成含有Nco I和Xba I酶切位点的上下游引物P1和P2,上下游引物P1和P2分别具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的基因序列。采用PCR方法扩增faeG目的基因片段。将扩增的faeG目的基因片段与pMD18‑T载体连接,得重组质粒,转入大肠杆菌TOP10中,该重组质粒命名为pMD‑faeG,其具有SEQ ID NO.1所示的基因序列。(2)构建重组表达载体pNZ8148‑faeG:将表达载体质粒pNZ8148和pMD‑faeG用限制性内切酶Nco I和Xba I双酶切,纯化回收双酶切载体片段和目的片段。目的片段和双酶切载体片段连接后转化感受态E.coli MC1061,提取重组质粒,命名为pNZ8148‑fae G,其具有SEQ ID NO.2所示的基因序列。(3)构建表达大肠杆菌粘附素基因faeG的重组乳酸乳球菌:采用电转化方法将重组质粒pNZ8148‑faeG转化感受态细胞L.lactis NZ9000,利用氯霉素对转化子进行筛选,得重组菌,命名为NZ9000/8148‑faeG,其具有SEQ ID NO.3所示的基因序列。(4)大肠杆菌粘附素FaeG在乳酸乳球菌中的诱导表达及SDS‑PAGE、Westernblot分析:挑取重组菌NZ9000/8148‑faeG接种于含有10mg/mL氯霉素的GM17液体培养基中,30℃静置培养过夜。培养物以3%的比例转接于500ml含氯霉素GM17培养液中,培养至OD600=0.5~0.6时,加入诱导剂nisin,使其终浓度为5ng/ml,继续培养3h。
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