[发明专利]一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法

摘要

一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法，它涉及一种促进乳腺发育及泌乳的方法。方法：一、体外培养的乳腺上皮细胞；二、设计引物，PCR扩增出Kcnma1基因的全序列，然后与pGEM-T载体进行连接，再转化大肠杆菌DH5α，得克隆载体质粒；三、pSV-β-Galactosidase Control Vector质粒和克隆载体质粒进行双酶切，连接并构建表达载体，再转染体外培养的乳腺上皮细胞，使Kcnma1基因在体外培养的乳腺上皮细胞中过量表达，即完成。本发明中Kcnma1基因在泌乳期奶牛乳腺中高表达，通过实验验证了Kcnma1基因确实是能够促进奶牛乳腺上皮细胞发育以及乳产生的重要功能基因。

主权项

一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法，其特征在于促进奶牛乳腺上皮细发育及泌乳的方法按以下步骤进行：一、取荷斯坦牛泌乳期组织样并采用胶原酶‑胰酶消化法分离上皮细胞，然后置于细胞生长培养液中培养3代，得体外培养的乳腺上皮细胞；二、根据Kcnma1基因的mRNA序列设计引物，PCR扩增出Kcnma1基因的全序列，然后与pGEM‑T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得克隆载体质粒；三、pSV‑β‑GalactosidaseControl Vector质粒和克隆载体质粒分别使用AgeI和XbaI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建表达载体，再用表达载体转染体外培养的乳腺上皮细胞，使Kcnma1基因在体外培养的乳腺上皮细胞中过量表达，即完成奶牛乳腺上皮细发育及泌乳的促进；其中步骤一中细胞生长培养液由90ml的DMEM高糖培养基、10ml的FBS和10ml浓度为50mg/ml的胰岛素、100μl 10万单位/ml的青霉素和100μl 10万单位/ml的链霉素组成；步骤二中PCR扩增所用上游引物为5′‑GCACCGGTTGCTAGCTATGGCAAATGGTGGC‑3′，下游引物为5′‑GCTCTAGAGGCAGTGGATACACACATCAGAG‑3′，而且在上下游引物的5′端分别添加了限制性内切酶AgeI和XbaI的酶切位点。