[发明专利]中国黄连悬浮细胞培养生产小檗碱的方法

摘要

本发明涉及中国黄连悬浮细胞培养生产小檗碱的方法，包括从中国黄连外植体诱导愈伤组织、继代培养愈伤组织、悬浮培养中国黄连细胞、优良高产细胞系的筛选、细胞悬浮培养条件的优化、小檗碱的提取等步骤。本发明具有工艺流程简单，生产周期短，生产能耗低且无污染，生产过程不受地域、季节和气候等自然环境因素影响等优点。本发明有助于解决中国黄连资源短缺和保护中国黄连种质资源的可持续生长，并且有利于建立中国黄连悬浮细胞的大规模工厂化生产，为小檗碱生产提供新的途径。

主权项

中国黄连悬浮细胞培养生产小檗碱的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)取中国黄连茎段、叶片、叶柄作为诱导愈伤组织的外植体；(2)常规清洗和消毒后，在无菌条件下将茎切成厚0.2cm薄片，叶片切成0.5×0.5cm小块，叶柄切成0.5cm小段；(3)选用MS、B5、6，7‑V作为黄连愈伤组织诱导的基本培养基；(4)将步骤(2)所述备好的外植体接种于基本培养基附加0.5～3.0mg/L 2，4‑D和0.1～0.5mg/L KT的固体培养基上，所有培养基的pH均为5.0～6.0，蔗糖1～8％，琼脂0.6～0.7％。培养温度21±1℃，暗培养；(5)在步骤(4)所述的培养基上，2～4周进行一次愈伤组织的继代培养，培养条件同步骤(4)；(6)中国黄连细胞的悬浮培养，经3～5次继代后，选取较松散的愈伤组织分散均匀，接种于步骤(4)所述不加琼脂的液体培养基内，置于恒温振荡器上进行液体悬浮培养，转速100～130转/分钟，培养温度23±1℃；(7)小檗碱提取：培养细胞收获后，称取鲜重与干重，计算产率和生长速率。精密称取于60℃下干燥至恒重的样品，甲醇回流提取，定容过滤后，测定小檗碱含量。