[发明专利]一种利用微量基因组DNA进行全基因组甲基化位点精确检测的方法

摘要

本发明在Illumina常规标签文库测序及甲基化常规测序基础上，结合常规文库标签测序方法，建立了新的利用微量基因组DNA进行全基因组甲基化位点精确检测的方法。而且本发明在使用微量基因组DNA进行甲基化文库构建时创新性的通过添加外源NA进行重亚硫酸盐高效共处理；同时不需要进行片段大小选择，在重亚硫酸盐处理后直接进行PCR扩增。本发明的方法克服了常规甲基化测序中不能混合样品，PCR扩增效率低及不能对微量DNA样品进行研究的缺点。

主权项

构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，所述方法用于微量基因组DNA，优选的是纳克级别的基因组，更优选的是30‑100ng的基因组，所述方法包括如下步骤：步骤A目的基因组DNA及外源基因组DNA的片段化目的基因组DNA和作为外源基因组DNA的材料可以为任意物种，其中包括各种植物、动物、微生物，例如人，植物特别是拟南芥，昆虫，特别是哺乳动物包括人、小鼠的基因组DNA；进行片段化的方法包括雾化、超声片段化、HydroShear或酶切处理，从而将基因组DNA打断为大小优选地为100‑200bp的片段；片段化方法中优选地采用超声片段化法，外源基因组DNA优选地选择拟南芥基因组DNA；步骤B基因组DNA的末端修饰对于经片段化的DNA，首先利用聚合酶包括但不限于Klenow、T4聚合酶和T4多聚核苷酸激酶以及dNTP补平末端，以产生平端化的DNA；然后优选地利用Klenow Frgment(3’‑5’exo‑)聚合酶及dATP在补平的序列的3’末端加上“A”碱基；步骤C微量建库接头连接及重亚硫酸盐处理将步骤B所得到的3’末端加上“A”碱基的DNA序列在连接酶包括但不限于T4连接酶的作用下与经甲基化修饰，优选地C位点甲基化修饰的微量建库接头进行连接，优选地在序列两端都连接上微量建库接头；然后在两端加了接头的片段中加入100‑500ng，优选的200ng步骤A中片段化了的拟南芥基因组DNA，然后一起用重亚硫酸盐处理，优选地处理2小时，从而使非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶；步骤D PCR扩增及文库切胶纯化以步骤C所得到的重亚硫酸盐转换后的DNA为模板，加入针对微量建库接头序列的PCR引物序列，进行PCR扩增；PCR扩增优选地使用热启动taq酶，所述热启动taq酶包括但不限于常规的r‑taq或其它聚合酶，扩增产物使用优选地2％的琼脂糖进行电泳并将目的条带切下纯化后，即为待测序的文库。