[发明专利]高效双启动子PLEGFP-N1-spMyoD1绿色荧光逆转录病毒载体构建及使用方法

摘要

一种高效双启动子PLEGFP-N1-spMyoD1绿色荧光逆转录病毒载体构建，属于动物基因工程及动物分子育种工程技术领域，其特征是：人工合成一骨骼肌特异启动子序列、采用RT-PCR方法从猪的骨骼肌组织中扩增基因全长序列；设计融合引物、利用重叠PCR扩增方法获得启动子和融合基因序列，T/A克隆到pMD18-T载体中，构建PLEGFP-N1-spMyoD1双启动子高效表达载体，经限制性内切酶鉴定并测序；用脂质体法包装、扩增，对病毒滴度和感染效率进行监测。有益效果是：1.应用Primer Premier5.0，DNA Club和Oligo 6.0自行设计出引物。2.克服了过去的目的基因无法特异性组织表达的局限性。3.同时提高了对目的基因功能研究的针对性和准确度。4.具有检测快速、便捷，可靠性强的优点。

主权项

一种高效双启动子PLEGFP‑N1‑spMyoD1绿色荧光逆转录病毒载体构建，其特征是：首先人工合成一骨骼肌特异启动子SP序列、采用RT‑PCR方法从猪的骨骼肌组织中扩增MyoD1基因全长CDs序列；设计融合引物、利用重叠PCR扩增方法获得启动子SP和pMyoD1的融合基因序列，T/A克隆到pMD18‑T载体中，双酶切后将融合基因亚克隆入以真核表达绿色荧光蛋白为标记的逆转录病毒PLEGFP‑N1载体，构建PLEGFP‑N1‑spMyoD1双启动子高效表达载体，经限制性内切酶鉴定并测序；用脂质体法转染293T细胞系包装、扩增，对病毒滴度和感染效率进行监测。