[发明专利]使用盐酸金刚乙胺药剂对百合脱毒培养的方法

摘要

本发明公开了使用盐酸金刚乙胺药剂对百合脱毒培养的方法，属于植物组培快繁技术和生物技术领域。该方法包括：百合种球病毒的检测、培养基的配制、备用、外植体灭菌和接种、外植体培养、组培苗的病毒检测等步骤，快速获得大量脱毒组培苗。本发明通过正交法获得百合直接分化成芽和无根组培苗的最佳诱导培养基配方，以及通过配制一系列浓度梯度的盐酸金刚乙胺抗病毒药剂，筛选出最适脱毒浓度，脱毒效率可达到93％，不仅缩短了诱导培养周期，还具有脱毒率高，增值系数高等特点，为培育百合无病毒植株，推广无毒化栽培的研究提供了技术基础。

主权项

1.使用盐酸金刚乙胺药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于按如下步骤进行：(1)材料选取：“西伯利亚”(Siberia)、“索邦”(Sorbonne)种球；(2)百合种球病毒的检测：选取供试种球的球茎鳞片，提取总RNA，反转录后作为模板，采用反转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)检测，确定种球鳞片是否携带病毒；(3)培养基的配制、备用：基本培养基为MS培养基；采用正交法研究6-BA和NAA浓度对百合组培的影响，确定可直接分化成芽和无根组培苗的最适6-BA和NAA浓度，配制最佳诱导培养基；采用1，3，5，6，7，8，9，10，12，14，16，18mg/L的浓度配制含抗病毒药物的培养基。抗病毒药物采用0.2u滤膜过滤除菌。(4)外植体灭菌、接种：将检测被病毒感染的百合鳞茎用自来水冲洗过夜，0.1％升汞灭菌10分钟，然后在70％酒精浸泡20秒。取出材料，用无菌水冲洗5-6遍。将材料切割成2.0mm×2.0mm小方块，接种于最佳诱导培养基上培养。(5)外植体培养：在温度22±1℃，光照12h/d，光照强度1500Lx的环境条件下培养45-50天，百合鳞茎外植体直接分化成鳞茎芽和无根组培苗。进一步将叶片切下，将组培小鳞茎纵切2-4块分别接种于对照组(诱导培养基)和实验组(诱导培养基+一定浓度的抗病毒药物)上，继续培养；连续切割，继代三次后，RT-PCR检测病毒苗携带病毒的情况。(6)组培苗病毒检测：根据检测病毒的种类：百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)，黄瓜花叶病毒(CMV)，百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)病毒，百合丛簇病毒(Lily rosettle virus，LRV)按照已知基因序列设计特异性引物，经RT-PCR检测无扩增为阴性脱毒苗。