[发明专利]糖核苷酸的酶法制备

摘要

本发明涉及糖核苷酸的酶法制备，即利用分子生物学技术构建糖核苷酸合成酶表达载体，转化入大肠杆菌进行过量表达，目的蛋白进行粗略纯化后在体外催化糖核苷酸的合成。本发明涉及三类四种糖核苷酸的酶法合成：GDP-Fuc、CMP-Sia、UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc。使用本发明描述的方法能够大量制备糖核苷酸，并大大简化制备步骤和降低制备成本。

主权项

1.糖核苷酸的酶法制备，包括三类糖核苷酸，分别是GDP-Fuc、CMP-Sia、UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc，由下述步骤组成：(1).酶表达载体的构建：克隆出GDP-Fuc合成酶(FKP)、氮乙酰六糖胺激酶(NahK)、GlcNAc-1-Puridyltransferase(GlmU)、CMP-Sia合成酶(NmCSS)，经酶切后插入大肠杆菌载体，分别命名为v-FKP、v-NahK、v-GlmU、v-NmCSS；(2).酶的过量表达与纯化：上述表达载体分别转化入大肠杆菌形成表达特异酶的工程菌株。阳性克隆工程菌株接种于LB培养基中，37℃培养10-12小时后转接入新的LB培养基中，37℃继续培养2-4小时，摇床转速为200-250转/分钟；当方发酵液浓度达到OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入IPTG诱导蛋白表达20小时，温度为16℃，摇床转速为200-250转/分钟；菌体通过离心收集，经过细胞破碎后使用亲和层析纯化目的蛋白；(3).糖核苷酸GDP-Fuc的酶法制备与纯化以等物质的量的L-岩藻糖、ATP、GTP为底物，反应液中加入终浓度为20mM的氯化镁和每克反应10个单位的焦磷酸水解酶，反应在GDP-Fuc合成酶FKP的作用下进行，使用薄板层析检测反应的进度；待反应完成后，反应液与活性炭混合，使用10体积的水和20体积的10％的乙醇洗涤，然后使用含有5％氨水的35％乙醇洗脱；洗脱液经浓缩并真空抽去氨水和乙醇后进行离子交换纯化，最后使用氯化钠溶液洗脱；得到的溶液使用活性炭除盐。(4).糖核苷酸CMP-Sia的酶法制备与纯化以等物质的量的唾液酸、CTP为底物，反应液中加入终浓度为20mM的氯化镁，反应在CMP-Sia合成酶NmCSS的作用下进行，使用薄板层析检测反应的进度；待反应完成后，使用与步骤(3)中相似的方法纯化；(5).糖核苷酸UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc的酶法制备与纯化以等物质的量的氮乙酰葡萄糖胺/氮乙酰半乳糖胺、ATP、UTP为底物，反应液中加入终浓度为20mM的氯化镁和每克反应10个单位的焦磷酸水解酶，反应在NahK和GlmU的作用下进行，使用薄板层析检测反应的进度；待反应完成后，反应液与活性炭混合，使用与步骤(3)中相似的方法纯化。