[发明专利]一种由雷公藤悬浮细胞诱导胚状体的方法

摘要

本发明公开了一种由雷公藤悬浮细胞诱导胚状体的方法，该方法以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为原始材料，对外植体进行愈伤组织诱导、继代培养，建立悬浮细胞系，通过悬浮细胞系诱导胚状体，通过胚状体的稳定性培养、继代保存、培养条件优化，即可用于扩大培养生产雷公藤甲素和生物碱。该方法得到的胚状体中雷公藤甲素和总生物碱的含量与根皮粉含量相近。利用该方法生产雷公藤甲素和总生物碱，具有生产周期短、效率高、对环境无污染等特点，并且有利于雷公藤自然资源的保护。

主权项

一种由雷公藤悬浮细胞诱导胚状体的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：步骤一，以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为外植体；用洗洁精洗涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗2小时，用含75%质量分数的酒精消毒10s，然后以无菌水冲洗4次，再用1g/L HgCl2消毒4min，无菌水冲洗4次；步骤二，将不定根的幼根切成小段；接种在培养基上，放置在培养室进行愈伤组织诱导，培养基组成为：MS+（0.5～1.0）mg/L 2,4‑D+（0.1～0.5）mg/L KT，pH值为5.8，并在培养基中加入蔗糖30g/L，培养室温度为25+1℃，保持每天16小时的光照，光照强度为1000～1500lx，20～30天后形成愈伤组织；步骤三，将形成的愈伤组织置入培养基中继代培养，40～45天继代一次，连续继代5代，培养基组成为：6,7‑V+1.0 mg/L 2,4‑D+0.5 mg/L KT；步骤四，挑选生长快、有光泽、质地疏松，颗粒状愈伤组织，接种量为5%～10%（w/v），接种在培养基上建立雷公藤悬浮细胞系，培养基的组成为1/2MS+60ml/L椰汁，选择250 mL三角瓶，装培养基120 mL，放入培养室中的摇床上震荡培养，培养条件为：温度25+1℃，自然光照，摇床转速110转/分钟，每25～30天继代培养一次，连续继代培养3次以上，即获得雷公藤悬浮细胞系；步骤五，用对数期生长的雷公藤悬浮细胞系，选取直径在1mm以下、分散性好、颗粒状雷公藤悬浮细胞系转接在1/2MS+（0.5～1.0）mg/LNAA培养基上进行胚状体的诱导，接种量为鲜重5g/L～10g/L，培养30天可产生胚状体，继续培养至60天，有85%的细胞团产生长度为0.5cm～3cm的胚状体；步骤六，胚状体的稳定性培养：继代时在超净工作台上，挑选步骤五诱导的胚状体中，长度为1cm～2cm、分散性好，颜色鲜亮、有明显分化的胚状体，进行继代培养，在步骤五相同培养基上连续培养5代以上，即可形成稳定的胚状体培养体系；同时将筛选的生长旺盛、颜色鲜亮、分化明显的胚状体，继代保存在1/2MS+（0.5～1.0）mg/LNAA培养基中，30天继代一次，1/2MS培养基组成为NAA 0.5～1.0 mg/L，蔗糖30～40 g/L，pH值为5.8；步骤七，对胚状体进行生产培养时，1/2MS培养基组成为NAA 0.5～1.0 mg/L，蔗糖30～40 g/L，pH值为6.1，培养至第40天收获。