[发明专利]一种发根农杆菌K599介导的菊花转基因方法

摘要

本发明提供了一种菊花再生效率高的发根农杆菌K599介导的菊花转基因方法，所述方法是利用活体植物材料直接作为发根农杆菌K599侵染的受体诱导不定根(以发根农杆菌K599菌液侵染菊花叶片伤口处或者叶腋处)，不定根再诱导愈伤组织进行分化培养获得完整植株，其有益效果主要体现在：能克服假阳性不定根的出现；同时，利用不定根繁殖过程中顶端生长点区域无菌的特点，通过截取不定根顶端靠近生长点区域进行继代培养，结合使用头孢霉素杀菌，能达到有效抑制和杀灭农杆菌的目的，在随后的不定根诱导愈伤及分化过程中无须再使用抗生素杀菌，提高了转基因再生效率。

主权项

一种发根农杆菌K599介导的菊花转基因方法，所述方法包括：(1)将发根农杆菌K599菌液侵染菊花无菌苗叶片或叶腋，诱导形成转基因不定根；(2)当转基因不定根生长到2cm以上后，从顶端剪取0.4～0.8cm长度的转基因不定根，转入继代培养基进行繁殖，每隔15～20天剪取长度0.4～0.8cm的转基因不定根顶端转入新的继代培养基，按此方法进行传代培养2～3代后再转入诱导培养基进行诱导培养，将诱导出的愈伤组织转入分化培养基进行分化培养，将分化出的苗转入生根培养基形成带根的完整植株；所述继代培养基为添加500mg/L头孢霉素的MS培养基；所述诱导培养基为添加0.5mg/L 6‑苄氨基嘌呤+1mg/L萘乙酸的MS培养基；所述分化培养基为添加2mg/L 6‑苄氨基嘌呤的MS培养基；所述生根培养基添加0.5mg/L生长素的MS培养基；上述培养均在带盖培养瓶中进行；(3)分化出的完整植株长至5～6cm时，打开培养瓶盖练苗3d后，再移栽到泥炭∶砻糠灰∶珍珠岩体积比3∶1∶1的土壤中，在自然条件下生长，获得转基因菊花。