[发明专利]一种油菜种子发育极早期种皮颜色鉴定试剂盒及鉴定方法

摘要

本发明涉及一种鉴定试剂盒，具体公开了一种在油菜种子发育极早期快速鉴定种皮颜色的鉴定方法。本发明的试剂盒及鉴定方法是依据在油菜黄黑籽发育极早期差异表达基因的序列设计的一对引物为主体的基础上而产生的。本发明采用反转录——聚酶链式反应（RT-PCR）技术，对油菜发育早期（开花4-5天后）种皮（去掉种脐部分）的特异RNA核酸片段进行的定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高，可以广泛应用于油菜种皮颜色育种中的极早期选择，从而提高育种效率，加快育种进程，节约育种成本，提高科学管理效率，具有很高的使用价值。

主权项

一种油菜种子发育极早期种皮颜色鉴定试剂盒，其特征是，所述试剂盒由下列部件组成：（1) RNA提取A液，内装Trizol液；（2) RNA提取B液, 内装苯酚‑氯仿，苯酚、氯仿的体积比为25：24；（3) RNA提取C液, 内装异丙醇；（4) RNA提取D液, 内装75%乙醇；（5) RNA提取E液, 内装DEPC处理后高温灭菌的超纯水；（6) RT反应F液，内装反应缓冲液Buffer、dNTP、oligo dT引物、RNA酶抑制和反转录酶M‑MLV，各组分的体积配比为：反应缓冲液（5×Bbuffer）         2份dNTP                           1份oligo dT引物                     1份RNA酶抑制                     0.3份反转录酶M‑MLV                 0.5份DEPC处理的超纯水                4.2份； （7) RT‑PCR反应G1液, 内装含Mg2+的反应缓冲液Buffer、dNTP、Taq酶、正向引物F和反向引物R，各组分的体积配比如下：含mg2+的反应缓冲液（10×Bbuffer） 2份dNTP                            0.3份正向引物F                        1份反向引物R                        1份超纯水                          13.3份Taq酶                           0.4份； （8) RT‑PCR反应G2液, 内装含Mg2+的反应缓冲液，dNTP、Taq酶、内参基因Actin的正向引物ACTF和内参基因Actin的反向引物ACTR，各组分的体积配比如下：含mg2+的反应缓冲液（10×Bbuffer） 2份dNTP                            0.3份正向引物ACTF                    1份反向引物ACTR                    1份超纯水                          13.3份Taq酶                           0.4份；  （9) 阳性对照H1液，内装黑籽油菜阳性模板；（10)阴性对照H2液，内装黄籽油菜阴性模板。