[发明专利]一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法

摘要

本发明公开了一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法。本方法首先以枯草芽孢杆菌168为出发菌株，构建两个同源交换片段，利用同源重组原理，通过两次双交换过程构建了一个可调控的赖氨酸营养缺陷型菌株BS-PS。以大肠杆菌克隆载体pMD19-T为骨架构建了通用型整合突变载体PLC，以枯草芽孢杆菌中性蛋白酶nprE为失活靶基因，采用插入失活策略，以PLC为基础，构建了插入失活nprE的整合载体PLC-InprE，转化入BS-PS，通过一次单交换，以及一次自发单交换过程，以控制赖氨酸的合成为筛选标记结合PCR验证结果，对蛋白酶插入失活的突变菌株进行筛选。

主权项

一种无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于包括下述步骤：(1)分别构建SpovAF‑CM‑Lys和SpovAF‑Pspac‑Lys同源交换片段；(2)利用所述的SpovAF‑CM‑Lys转化枯草芽孢杆菌168感受态细胞，发生一次双交换，该菌株基因组上LysA基因天然启动子被置换为含有终止子的CM基因，得到赖氨酸营养缺陷型突变菌株BS‑CM；(3)利用所述的SpovAF‑Pspac‑Lys转化BS‑CM感受态细胞，发生一次双交换，所述的CM基因被替换为受LacI基因抑制调节的Pspac启动子，得到无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS‑PS。