[发明专利]一种基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法

摘要

本发明涉及一种检测核糖核酸的方法，尤其是一种检测微小核糖核酸（microRNA）的方法，属于生物技术领域。利用不对称PCR扩增结合液相芯片技术，先在生物样品中加入定量的外源性microRNA，将microRNA进行预扩增及扩增得到扩增产物，并将修饰后的含有microRNA特征信息的特异性检测探针与荧光微球偶联制成液相芯片，扩增产物与液相芯片杂交后通过液相芯片检测仪检测，通过比较待检测microRNA的荧光信号与外源性microRNA的荧光信号的相对水平达到相对定量检测microRNA的目的，为microRNA的定量检测提供新的途径。

主权项

一种基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，包括以下步骤：步骤一、制备液相芯片，从Sanger MiRBase数据库中选取成熟的microRNA序列作为探针序列,在所述探针序列的5’端加上C12 分子臂和氨基修饰，并将修饰后的探针与不同编码的荧光微球偶联，得到特异性检测微球，即液相芯片；步骤二、设计引物和探针，在所述成熟的microRNA序列后8位反向互补序列的5’端加上CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG组成反转录引物，剩余序列的5’端加上ACACTCCAGCTGGG组成正向引物；并设计通用正、反向引物，在通用反向引物5’端第1位及第5位T碱基以生物素标记，在通用正向引物的第3位和第5位碱基进行锁核酸修饰；步骤三、在待检测的RNA中加入外源性人工合成的2种microRNA ，加入量为每50 ng待测RNA各加5 fmol；步骤四、对待测样品RNA进行反转录反应，得到合成的cDNA；步骤五、对所述cDNA进行预扩增反应，得到预扩增产物；步骤六、对所述预扩增产物进行不对称PCR扩增反应，得到待测样品的PCR扩增产物；步骤七、将所述待测样品的PCR扩增产物与特异性检测微球杂交，得到杂交反应产物；步骤八、将所述杂交反应产物离心弃上清后，与链霉菌抗生物素蛋白‑藻红蛋白反应，得到反应产物；步骤九、用液相芯片检测仪对步骤八中的反应产物进行检测，得到检测结果。