[发明专利]将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法

摘要

本发明公开了将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一整合位点的方法。首先将外源基因表达单元克隆到含抗性基因筛选标记A的整合质粒，利用整合质粒将外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体获得重组菌1，然后利用替换抗性基因筛选标记的质粒将重组菌1中的抗性基因筛选标记A替换为另一抗性基因筛选标记B，得到重组菌2。整合质粒再转化重组菌2，通过抗性基因筛选标记A和B进行筛选得到包含两个外源基因表达单元的重组菌。重复替换抗性基因和整合，可以获得两个以上相同或不同的外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体的重组菌。这种方法对构建整合型枯草芽孢杆菌表达菌株具有重要的应用前景。

主权项

将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法，其特征在于，是一种利用多种抗性基因筛选重组菌，将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一整合位点的方法，具体步骤是：1)将外源基因表达单元分别单独克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，每一个重组整合质粒携带一个外源基因表达单元；2)第一个外源基因表达单元的整合是利用整合质粒将外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体中，通过整合质粒上携带的抗性基因筛选标记A挑选得到外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌1；3)用替换抗性基因筛选标记的质粒将上述重组枯草芽孢杆菌1的抗性基因筛选标记A替换为抗性基因筛选标记B，通过抗性基因筛选标记B将替换成功的重组菌挑选出来，得到带抗性基因筛选标记B的重组枯草芽孢杆菌2；4)第二个外源基因表达单元的整合是利用连接有第二个外源基因表达单元的整合质粒以同源单交换形式将第二个外源基因表达单元整合到重组枯草芽孢杆菌2上，通过抗性基因筛选标记A和抗性基因筛选标记B筛选得到含有两个外源基因表达单元的重组枯草芽孢杆菌；5)重复上述步骤3)和步骤4)，将抗性基因筛选标记A替换为其他抗性基因筛选标记后，用连接有外源基因表达单元的整合质粒以同源单交换形式整合到重组菌中，可以得到两个以上表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组菌；所述的外源基因表达单元可以相同或不同：如不同，得到不同外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组的重组菌；如相同，得到两个或两个以上拷贝的外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组的重组菌；所述的外源基因表达单元可以是单顺反子，也可以是多顺反子；所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168衍生菌株。