[发明专利]一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法及应用，步骤：1）提取芒属植物五节芒的基因组DNA；2）利用限制性内切酶酶切上述所提取的总DNA，获得基因组DNA片断；3）探针与目的片断的杂交；4）利用磁珠对上述中的含有SSR序列的杂交DNA分子进行富集；5）对含有SSR序列的DNA片断进行扩增并纯化；6）将DNA片断进行克隆测序；7）SSR的侧翼序列设计SSR引物，运用引物设计软件设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断。方法易行，操作简便，同时，SSR标记自身具有共显性、多态性高、多等位基因的特性等特点，不仅能够用于芒属植物遗传多样性和亲缘关系分析，还可以应用到芒属植物遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图的绘制中。

主权项

一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其步骤是：取芒属植物五节芒幼嫩叶片提取总DNA；利用限制性内切酶酶切上述步骤a）所提取的总DNA，获得基因组DNA片断，步骤如下：取125ng基因组总DNA5μL，在20μL酶切体系中，用限制性内切酶Mse I于37℃酶切3h，然后65℃温育10min，酶切结束后连接上接头，连接反应为25μL体系，反应在16℃下连接过夜，连有接头的DNA经PCR预扩增获得拷贝，预扩增引物为MseI‑N 5’‑GAT GAG TCC TGA GTA AN‑3’，PCR反应体系25μL；PCR反应程序为：首先95℃预变性5min，然后在94℃变性30 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min； 循环次数16‑28个，最后72℃终延伸10min，取3μL扩增产物产物使用1%质量体积比琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，余下部分置4℃保存备用；探针与目的片断的杂交，步骤如下：将预扩增产物与生物素标记的探针biotin‑(AG)13在分子杂交炉内65℃下杂交2h，杂交反应为100μL体系：20×SSC：0.7μL；0.1%质量体积比SDS：0.7μL；预扩增产物：25μL；Biotin‑(AG)13探针：6μL；ddH2O：67.6μL，获得的杂交液置4℃保存备用；利用磁珠对上述步骤c）中的含有SSR序列的杂交DNA分子进行富集，具体如下：（1）、磁珠预处理：取一管包被有链亲和素的磁珠，拍打管底，然后用枪吹打直至磁珠分离开，用磁力架收集，磁珠悬停30s，吸走上清液；用0.5×SSC洗涤磁珠3次，每次5min，每次洗涤完毕即用磁力架固定磁珠，至磁珠光滑为止，洗好的磁珠置于100μL0.5×SSC中备用；（2）、磁珠富集：将备用杂交液加入到磁珠管中，室温下放置30min，每5min用枪吹打3次，每隔1min用手摇；用磁力架收集去掉上清液；用0.1 X SSC洗涤磁珠3次，每次5min，然后用TEN1000洗涤3次，每次5min，再用300ul TEN1000于65℃预热后，洗涤2min；（3）、目的DNA片段的洗脱：磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液，然后再加入100μLTE95℃水浴5min，其间不时吹打均匀；用磁力架固定磁珠后，吸出上清液，置于EP管中标记，再次用150μL TE进行第二次洗脱，用磁力架固定磁珠后，吸出上清液，置于EP管中标记，最后将两次洗脱后的产物冻存于‑20℃冰箱备用；（4）、含有SSR序列的DNA片断的PCR扩增：对洗脱后的目的DNA进行PCR扩增，扩增体系为25μL，PCR反应程序为：首先95℃预变性2min，然后在94℃变性30 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min；进行30个循环，最后72℃终延伸10min，取3μL扩增产物产物使用0.8%琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量；对上述步骤d）中所得含有SSR序列的DNA片断进行扩增并纯化，具体如下：PCR扩增后的产物，切取200bp‑750bp的DNA片段范围内的琼脂糖凝胶装在1.5mL离心管中，使用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，回收后的DNA在EB染色的0.8％质量体积比琼脂糖凝胶上电泳，检测回收DNA的质量，置于‑20℃保存备用；将上述步骤e）中所得的DNA片断进行克隆测序；具体方法如下：（1）、目的DNA片断的体外连接：将回收纯化后的PCR产物，使用连接试剂盒进行，反应体系为5μL，16℃连接过夜；（2）、连接产物的转化：采用热激法将已连接目的片断的载体转化入DH‑5α感受态细胞；（3）、挑选阳性克隆并测序：用菌落PCR技术筛选阳性克隆，首先使用通用引物SP6/T7进行筛选，排除非阳性克隆，反应体系为25μL，对进行完第一次筛选后的菌液，用MseI‑N和不含生物素探针标记的（AG）13为引物进行第二轮PCR扩增筛选，反应体系为25μL，所得PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳，用DL2000作为marker，挑选不同大小的阳性克隆送样测序；根据SSR的侧翼序列设计SSR引物，在测序的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性，运用引物设计软件Primer 5.0设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断，引物设计：引物长度为18‑25bp，退火温度为50‑68℃，GC含量为36%‑67%，预期PCR扩增产物长度为105‑297bp，所述的引物如下：Mf1F:ATATGCGTATGGTGTGTATGATGATR:AGGTGATAGGTCTAGCCGATGCMf2F:GGTCGTCCGCTCTCCCTGTR:TCCACGAAGAACTCACTCCAATCMf3F:AAGTTTGTTGATGTGGCGTGATR:GGAGAAAGCGAGCGAAGA Mf4F:GCAGGGAGTGAGACAGCTR:ACATCACATCCTCGTCCAMf5F:CCACACCAGCAGTACTCCAGCR:GAAAACCTAATAAAAGGGCACGATMf6F:GCGATGTTGACTTTTGCTGCTR:GAGCTGCACAACGGGGATTAMf7F:AATCTGTATGTCCCAAACTCACCR:GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTAMf8F:GACCATAGTCCAGAGTATTCGCR:CATCGACGTCACCAAGAAATMf9F:TGGGGCGAAGCAGACATAGR:GTCTGTCCGTTGCCCTGCMf10F:CTGTCGTATGAGCTGCCATCR:AAACCGGTACGGGTGAATCTMf11F:CTCTCTCCTTTGTTTCCTTTGGR:CATAAGTAAACGGCTGAACCACMf12F:TCAAGGAAACAGGTGATAGGTCTR:ACCTTTTTCAGTCAGCCACACMf13F:GCGACGAGACAAGGCGCAAGTR:TAGGCCGGGAAGCGAAGACCMf14F:CAGTCCCAGACTGCATTGAAR:ATGTCAGCAGTGACCCACAAMf15F:CCAAGGGCTTAGGATTGACAR:GCCAAGGTACAAGCCGTAGAMf16CCCGCTATGAGCTACAGGAGCGAGTGCCTACCATCATCCTMf17F:TTCTTGTGCCTGGCTATGAGR:GACAGAGCAGTGAACCATTTACAMf18F:AGGAGGATAAGAATAATGAGGGTGAR:TGCTCACAACCACAGAACCGMf19F:ATTTGGCTCATGGGCTGGGTR:AGGTTAGCACTTAGGGTTTCATCAAMf20F:GCGATGTTGACTTTTGCTGCTR:GAGCTGCACAACGGGGATTAMf21F:CGACTGGAATTTGGGTAATATGAR:CCACATGAAGAGGAAGAAAAACTATMf22F:TTCAACGTGATTAGTGTGAAAGCR:AGTGGTATGGACGAGATGGTGMf23F:GTGGCGACTCTCCGATACCR:GCAACCTATGTTCCAAACTTACTMf24F:ATGAAAGGATTAGCCAGAGGTTAGR:CTTTGCCTGTCTCTCACATCTTGMf25F:ATCAGAGCAAGCAATCAAGAGAR:TTTATTGTATTTCTGAGCCTCTGTCMf26F:GCAAACGCACGAAGGTAGGR:CCTCCTTTTCTCACCATTGTCGMf27F:CTTAGAGCGAGAACAACAATTATCCR:GGCTTGATGAGAACTGAGAGAAATMf28F:TGCCCGTATTGGATGAAACCTCR:TGCCACAGCGATGCCGAATMf29F:AGGAAATGGGGCACAAAAACTR:GCAGGTGGTTTTCATAAGATTCCMf30F:ACTTCTACACTTCTCCCATGTCCTCR:CACGGTGAGATTCGGTAGCGMf31F:CCGGGGTGAGAAATCTGTGR:AAACCAGGGACGGCATAGATMf32F:AATCTGTATGTCCCAAACTCACCR:GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTAMf33F:TAATGTCTTGTCAGCTTTGAGTTGGR:AAGAAGAGGTGGAAAGGCAAGTTMf34F:CGACTTTTATTGTAATCGTTATCTCR:GAGGAACAACTACTGCGGATAC。