[发明专利]生脉注射液中微量蛋白的测定方法

摘要

本发明公开了生脉注射液中微量蛋白的测定方法，该方法包括：水提取醇沉淀法制备抗原；家兔免疫法制备抗生脉抗原血清并进一步纯化制备抗体；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定生脉注射液中的微量蛋白含量。本发明解决了生脉注射液中微量蛋白含量无法快速检测的难题，对提高生脉注射液产品的质量，防止临床过敏反应具有重要意义。

主权项

一种生脉注射液中微量蛋白的测定方法，包括如下操作步骤：（1）制备生脉抗原：取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，水煮回流提取，回流液过滤，滤液用乙醇沉淀，过滤，收集沉淀物，沉淀物水复溶后冻干，即得生脉抗原；（2）抗生脉抗原抗体的制备：抗原用完全福氏佐剂初次免疫后，用不完全佐剂新西兰兔足趾内或皮下多点注射，剂量以所含蛋白计为0.5‑5mg/只；数次免疫后新西兰兔动脉采血，分离血清合并，封装，10‑20℃冻存，用于纯化免疫球蛋白G，制得抗生脉抗原抗体；（3）酶联免疫吸附试验:称取生脉抗原3mg‑15mg，加包被液配制为2‑50mg/ml储存液备用；用包被液将生脉抗原储存液倍比稀释为100μg/ml ‑ 2ug/ml浓度范围，100μl/孔包被在96孔聚乙烯酶标板上；待测生脉注射液每批号3孔以上，每孔100μl包被；4oC湿盒过夜；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗2‑3遍，拍干；用5%小牛血清溶液封闭10‑15分钟；弃去溶液，加入100μl 1∶100稀释的兔抗生脉血清1‑3小时；弃去溶液；磷酸盐缓冲溶液洗4‑5遍，拍干；加入100μl 1：3000辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G溶液避光室温孵育1‑3小时；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗4‑5遍，拍干；加100μl邻苯二胺/过氧化氢底物磷酸缓冲液，临用前10‑15分钟配制：称取10‑15mg邻苯二胺，用10‑15ml磷酸缓冲液溶解，临用前加10μl过氧化氢，混匀，每孔加100μl进行显色；显色适当后，加100μl的2mol·L硫酸终止反应，用酶标仪在490 nm 处记录吸收度；以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟，根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。