[发明专利]一种可溶性人重组MICA蛋白的制备方法无效

专利信息
申请号: 201110003536.5 申请日: 2011-01-10
公开(公告)号: CN102154302A 公开(公告)日: 2011-08-17
发明(设计)人: 曹利平;丁国平;阙日升 申请(专利权)人: 浙江大学
主分类号: C12N15/12 分类号: C12N15/12;C12N15/866;C07K14/47;C07K1/36;C07K1/26;C07K1/20
代理公司: 杭州裕阳专利事务所(普通合伙) 33221 代理人: 冉国政
地址: 310027 浙*** 国省代码: 浙江;33
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摘要: 发明公开了一种可溶性人重组MICA蛋白的制备方法,步骤一:取健康成年志愿者捐献的体外外周静脉血30ml,生理盐水稀释后用淋巴细胞分离液分离出灰白色淋巴细胞层;步骤二:利用TRIZOL提取经处理的灰白色淋巴细胞的RNA,经序列筛选后植入杆状病毒基因组内,重组,收集,透析,离心获取MICA蛋白,用CENTRICON超滤器过滤;步骤三:目标蛋白的纯化;步骤四:MICA目标蛋白的鉴定。本发明制备方法制得的可溶性重组MICA蛋白,分子结构域更加接近自然态的MICA蛋白,具有方便,快捷,敏感,重复性好等优点;在体外免疫排斥模型中的成功应用,为动物体内实验和临床应用提供了实践支持和打下了坚实的基础。
搜索关键词: 一种 可溶性 重组 mica 蛋白 制备 方法
【主权项】:
一种可溶性人重组MICA蛋白的制备方法,其特征在于包括以下步骤:步骤一:取正常健康成年志愿者捐献的体外外周静脉血30ml,先用生理盐水稀释后10倍,然后使用淋巴细胞分离液分离出灰白色淋巴细胞层,用PBS液对所述灰白色淋巴细胞层洗涤,在该过程中,使用台盼兰计数单个核细胞活性;步骤二:利用TRIZOL提取经步骤一处理的灰白色淋巴细胞的RNA,利用PCR技术合成和扩增特异性MICA基因片段,KpnI 和XboI限制性内切酶切取所需要片段克隆入pEnter‑3C质粒,经过序列筛选后利用Baculovirus Expression System and Gateway技术直接植入杆状病毒基因组内,重组的杆状病毒DNA转染S9f昆虫细胞,收集病毒后放入无血清的EXPRESS FIVE SFM培养基中,3天后用50mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0.溶液透析,离心获取上清后用镍亲和力琼脂糖提取MICA蛋白,利用CENTRICON 超滤器过滤;步骤三:目标蛋白的纯化a.二维聚丙烯酰胺凝胶电泳:将目标蛋白在IPG胶条上上样,聚焦步骤后洗涤,加SDS还原剂,连接到SDS‑PAGE平板凝胶中,并以考马斯亮蓝染色,切取宽约1mm的目标蛋白条带,用50%甲醛和10%醋酸进行脱色及去除SDS;b.串联高效液相层析:与2D‑SDS‑PAGE相比,它利用不同分离模式的结合,使混合物中的肽得到更大程度的分离,并且降低低丰度肽的丢失;步骤四:MICA目标蛋白的鉴定:是MICA基因的特异性抗体,用Western Blot对MICA基因的特异性抗体Mab 1.7A8进行反向验证。
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