[发明专利]一种猪体细胞诱变方法

摘要

本发明公开了一种猪体细胞诱变方法，利用携带增强型绿色荧光蛋白标记的慢病毒多次感染作用胎猪成纤维细胞，在干细胞培养液的生长环境条件下胎猪成纤维细胞逐步改变原有的纤维状生长形态，形成鸟巢状细胞集落，分离培养传代的细胞集落边缘界限清晰，生长状态稳定，核型正常，碱性磷酸酶表达为阳性，免疫细胞化学检测显示Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表达为阳性，体内分化形成含有三个胚层的畸胎瘤，结果证实慢病毒作用下发生诱变的猪体细胞具有干细胞特征。

主权项

一种猪体细胞诱变方法，其特征在于，步骤如下：1)取妊娠约60天左右的猪胎儿，采用组织块培养法添加胎猪成纤维细胞培养液建立胎猪成纤维细胞系；2)磷酸钙介导pLentiLox 3.7慢病毒表达载体及其包装组分pMDLg、pRSV REV和pVSVg在293T细胞中组建成慢病毒颗粒，12‑16小时后更换新鲜293T细胞培养液，病毒包装48小时后收集含慢病毒的293T细胞培养液，经超滤浓缩后添加到胎猪成纤维细胞培养板内；3)在胎猪成纤维细胞培养板内添加含终浓度为10μg/ml Polybrene的胎猪成纤维细胞培养液，此后，每天收集含慢病毒的293T细胞培养液，添加到胎猪成纤维细胞培养板中感染胎猪成纤维细胞2‑4次；4)将胎猪成纤维细胞培养板内的培养液更换为含胎牛血清的高糖DMEM培养液的猪诱变细胞培养液，再连续收集含慢病毒的293T细胞培养液2‑4天，并让所收集的慢病毒感染胎猪成纤维细胞2‑4次；5)当胎猪成纤维细胞中的细胞形态出现集落变化后，将细胞集落经Dispase II消化后接种到经丝裂霉素处理的12.5天小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，在饱和湿度培养箱中培养；经4次感染后1周在小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上形成鸟巢状猪干细胞集落。