[发明专利]快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法

摘要

一种快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，在报告基因的读码框内插入了锌指核酸酶的靶序列，破坏了报告基因的读码框。将携带该报告基因的载体整合到细胞中建立稳定表达该突变的报告基因的细胞系。将表达锌指核酸酶的载体和用于纠正的供体载体共转染到携带报告基因的细胞系后通过检测阳性细胞的比例检测锌指核酸酶的定点剪切能力。本发明将报告基因整合到真核细胞基因组中，通过报告基因的纠正，方便的观察基因的定点整合效率，实现对锌指核酸酶介导的基因定点整合的快速检测。本发明具有操作简单、实验周期短、成本低、检测结果准确的优点。

主权项

一种快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法，其特征在于它由以下步骤组成：(1)构建报告基因表达载体报告基因表达载体是在真核表达载体中同时表达报告基因和筛选基因；上述的报告基因被分成上游片段和下游片段，在上游片段和下游片段之间插入锌指核酸酶作用位点，该插入位点距报告基因的3’端或者5’端至少为50bp；上述的锌指核酸酶作用位点包含左侧锌指核酸酶结合位点和右侧锌指核酸酶结合位点，左侧锌指核酸酶结合位点和右侧锌指核酸酶结合位点之间包含5～7个碱基的间隔序列；(2)构建锌指核酸酶表达载体锌指核酸酶表达载体表达针对锌指核酸酶作用位点的一对锌指核酸酶，即左侧锌指核酸酶和右侧锌指核酸酶；(3)构建供体载体供体载体携带报告基因全长序列或部分序列；部分序列与上游片段、下游两段分别具有至少50bp的同源序列；(4)建立锌指核酸酶检测细胞系将报告基因表达载体导入到真核细胞中，通过筛选基因的筛选，获得稳定表达报告基因的真核细胞系；(5)检测锌指核酸酶介导的基因定点整合效率将供体载体和锌指核酸酶表达载体同时导入到锌指核酸酶检测细胞系中，统计报告基因纠正的细胞占所有导入锌指核酸酶表达载体和供体载体细胞的比例。