[发明专利]酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的高效表达纯化方法

摘要

本发明公开了酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的高效表达纯化方法。本发明方法是将酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的编码序列通过原核表达质粒pTWIN1转入到大肠杆菌中，构建得到的重组大肠杆菌可以通过IPTG诱导表达可溶性融合蛋白CBD-intrin1-MT。该融合蛋白中的CBD结构与能与几丁质柱结合，内含肽与金属硫蛋白成熟肽连接处发生自剪切作用，获得游离的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽。本发明方法生产的酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽与酿酒酵母的天然产物具有完全相同的氨基酸结构，安全可靠，具有清除自由基和吸附重金属的能力，在医药、食品、化妆品或重金属污染治理等领域有广阔的应用前景。

主权项

酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽的表达纯化方法，其特征在于包括如下步骤：（1）根据酿酒酵母S.cescerevisiae基因组序列，设计扩增金属硫蛋白成熟肽编码序列的上、下游引物，序列如SEQ ID NO:1~2所示；（2）以酿酒酵母菌株的基因组为模板，用步骤（1）所述引物进行PCR扩增；（3）将步骤（2）PCR扩增所得的产物连接到质粒pTWIN1上，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌ER2566，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌；（4）培养重组大肠杆菌至OD600值达到0.6时，加入IPTG诱导融合蛋白表达，收集菌液，离心、取上清，得到以可溶形式表达的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白；（5）将步骤（4）得到的酿酒酵母金属硫蛋白融合蛋白过几丁质柱进行亲和纯化，洗脱后进行自切割反应，反应完毕后洗脱收集，得到酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽。