[发明专利]一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法

摘要

本发明涉及一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法。本发明包括：酶液的制备、反应液制备、对照液制备、酶活性的检测、酶活力的计算五个步骤。其中利用高效液相色谱法检测酶反应产物酯型儿茶素来检测酶活性，在反应体系中加入抗氧化剂和水解酶抑制剂可以避免氧化酶和酯型儿茶素水解酶对酶活性检测的干扰。本发明方法简单，准确性强、灵敏度高，能够准确检测到酯型儿茶素合成酶反应产物；操作方便，检测时间短，避免了繁琐的实验操作，检测时间在2-3小时即可完成。

主权项

一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法，其特征在于包括以下操作步骤：1.1、酶液制备取2克茶树鲜叶，加入液氮，快速研磨成粉末状，再加入2克聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、0.5克石英砂、18mL预冷的0.1 mol/L pH 7.4的磷酸缓冲液溶液和2mL 20mmol/L的抗坏血酸溶液，4℃条件下研磨成匀浆，在离心机转速12000转/分钟、温度4℃条件下，离心分离15 分钟，取上清液，即得浓度1.2mg/mL的酶液；1.2、酶活性的测定1.2.1、反应液的制备总体积为1.5mL的反应液包括下列原料：酶液： 1.2mg/mL的酶液抗氧化剂：20 mmol/L的抗坏血酸溶液水解抑制剂：30.4 mmol/L的水杨酸溶液反应底物：3.8 mmol/L的表没食子儿茶素溶液或3.8 mmol/L的表儿茶素溶液、9.6 mmol/L的1‑O‑没食子酰‑β‑D‑葡萄糖溶液缓冲液：0.1 mol/L 、pH=6.0的磷酸缓冲液将0.46mL酶液、0.3mL抗氧化剂、0.074mL水解抑制剂、0.15mL反应底物表儿茶素溶液或0.15mL表没食子儿茶素、溶液0.075mL反应底物1‑O‑没食子酰‑β‑D‑葡萄糖溶液和0.59mL磷酸缓冲液混合均匀，温度30℃水浴反应60分钟，得反应液；1.2.2、对照液的制备反应液包括下列原料：酶液：温度100℃煮沸5分钟的酶液抗氧化剂：20 mmol/L的抗坏血酸溶液水解抑制剂：30.4 mmol/L的水杨酸溶液反应底物：3.8 mmol/L的表没食子儿茶素溶液或3.8 mmol/L的表儿茶素溶液、9.6 mmol/L的1‑O‑没食子酰‑β‑D‑葡萄糖溶液缓冲液：  0.1 mol/L、pH=6.0的磷酸缓冲液将0.46mL的温度100℃煮沸5分钟的酶液、0.3mL抗氧化剂、0.074mL水解抑制剂、0.15mL反应底物表没食子儿茶素溶液或0.15mL表儿茶素溶液、0.075mL反应底物1‑O‑没食子酰‑β‑D‑葡萄糖溶液和0.59mL磷酸缓冲液混合均匀，温度30℃水浴反应60分钟，得对照液； 1.2.3、反应甲醇液和对照甲醇液的制备在反应液和对照液中，分别加入3mL乙酸乙酯，分别在室温下萃取反应产物，重复萃取三次，分别收集合并反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相；将反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相，分别60℃减压浓缩10分钟，分别用甲醇溶解并定容至500微升，分别得到反应甲醇液和对照甲醇液；1.2.4、酶反应产物的高效液相色谱分析采用高效液相色谱技术分别检测反应甲醇液和对照甲醇液中表没食子儿茶素没食子酸酯或表儿茶素没食子酸酯的含量；在反应甲醇液中检测到表没食子儿茶素没食子酸酯或表儿茶素没食子酸酯，而在对照甲醇液中检测不到表没食子儿茶素没食子酸酯或表儿茶素没食子酸酯，即可以证明检测到茶鲜叶中的酯型儿茶素合成酶酶活。