[发明专利]制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的DNA片段的方法

摘要

本发明公开了一种制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的DNA片段的方法。本发明中，根据骨架载体上预期插入的多克隆位点设计两对引物，以含有目的基因的DNA为模板，分别用两对引物进行PCR扩增，得到两种PCR扩增产物，将两种PCR扩增产物混合后依次进行变性和退火，得到目的DNA片段(两端带有相应限制性内切酶的粘性末端，中间为目的基因)，目的DNA片段可以定向克隆至骨架载体的预期多克隆位点。与传统PCR产物克隆方法相比，本发明所提供的克隆方法简单易行，成本低，效率高，通用性好，可以广泛应用于PCR产物的快速定向克隆。

主权项

一种制备两端带有限制性内切酶粘性末端的双链DNA片段的方法，包括如下步骤：(1)制备引物对甲和引物对乙；所述引物对甲由上游引物甲和下游引物甲组成；所述引物对乙由上游引物乙和下游引物乙组成；所述引物对甲和所述引物对乙用于扩增同一目的DNA片段；所述上游引物甲的5′末端具有限制性内切酶甲识别序列中切割位点下游的全部序列；所述下游引物甲的5′末端具有限制性内切酶乙识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述上游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶甲识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述下游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶乙识别序列中切割位点下游的全部序列；(2)用所述引物对甲PCR扩增所述目的DNA片段，得到PCR扩增产物甲；用所述引物对乙PCR扩增所述目的DNA片段，得到PCR扩增产物乙；(3)将所述PCR扩增产物甲和所述PCR扩增产物乙混合后依次进行变性和退火，得到5′末端带有限制性内切酶甲识别序列的粘性末端且3′末端带有限制性内切酶乙识别序列的粘性末端的双链DNA片段。