[发明专利]一种13C、15N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法

摘要

本发明涉及一种13C、15N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)发酵菌种的选取；(2)发酵培养配方；(3)发酵工艺；(4)分离提取。本发明采用的发酵工艺适合13C、15N双标记L-赖氨酸盐酸盐的制备，在该工艺条件下的产酸率比采用全合成培养基的相应提高40％～60％，效果明显，通过控制碳源葡萄糖、无机氮源硫酸铵等及有机氮源玉米浆等的添加量，添加高丝氨酸、生物素、维生素B1等物质，改善了发酵配方。既使同位素丰度得到了控制，减少了丰度下降的风险，又保证了产酸率，使同位素原料得到有效利用，降低了生产成本，可利用不同丰度规格的原料来制备不同丰度的产品，满足各种丰度需求。

主权项

一种13C、15N双标记‑L‑赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)发酵菌种的选取选取适用于13C、15N双标记L‑赖氨酸盐酸盐发酵生产的菌种包括短杆菌属及棒杆菌属的变异株，包括黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicium)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)或钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)等；(2)发酵培养基配方发酵培养基中不添加或添加极少量的玉米浆等作为有机氮源，有机氮源的浓度为0wt％～2.0wt％，以13C‑葡萄糖为碳源，葡萄糖总的浓度为8wt％～15wt％，以含15N的硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素中的一种或几种为初始氮源，初始氮源的添加量为氮元素含量占总量的0.3wt％～1.5wt％，发酵过程中可流加含15N的尿素或氨水补充氮源，不添加或添加极少量的玉米浆、豆饼水解液、酪蛋白水解液、菌体水解液中的一种或多种作为有机氮源，该有机氮源的浓度为0wt％～2.0wt％，随菌种不同添加不同量的磷酸盐包括K2HPO4或KH2PO4，添加量为0.5g/L～4g/L；镁盐，包括MgSO4，添加量为0.2g/L～0.8g/L；亚铁盐，包括FeSO4·7H2O，添加量为0.01g/L～0.06g/L及锰盐，包括MnSO4·4H2O，添加量为0.01g/L～0.06g/L；另外添加高丝氨酸，添加量为0.05g/L～0.30g/L；生物素，添加量为100μg/L～1000μg/L；维生素B1，添加量为100μg/L～1000μg/L等；(3)发酵工艺采用摇瓶发酵或发酵罐发酵得到发酵液，所述的摇瓶发酵的工艺：将菌体接种于活化培养基的斜面或平板上，在28～35℃的培养箱中培养16～24小时，再将长好的菌体接一环于经灭菌的发酵培养基中，500mL三角瓶的装液量为20～30mL，于摇床上进行连续发酵培养；所述的发酵罐发酵的工艺：将菌体接种于活化培养基的斜面或平板上，在28～35℃的培养箱中培养16～24小时，再将长好的菌体接种于经灭菌的种子培养基中，在28～35℃摇床培养16～24小时，摇床转速180～220转/分钟，得到的种子培养液按体积比3％～10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，进行发酵培养；(4)分离提取发酵培养结束后，将含有13C、15N双标记L‑赖氨酸的发酵液采用离子交换法提取分离，得到13C、15N双标记L‑赖氨酸的单斑洗脱液，经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，再于50℃～60℃真空烘干，最终得到13C、15N双标记L‑赖氨酸盐酸盐产品。