[发明专利]一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法无效
| 申请号： | 201110065211.X | 申请日： | 2011-03-17 |
| 公开（公告）号： | CN102154252A | 公开（公告）日： | 2011-08-17 |
| 发明（设计）人： | 朱利民;陈天翔;聂华丽;汪雯 | 申请（专利权）人： | 东华大学 |
| 主分类号： | C12N9/50 | 分类号： | C12N9/50 |
| 代理公司： | 上海泰能知识产权代理事务所 31233 | 代理人： | 黄志达;谢文凯 |
| 地址： | 201620 上海市*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，包括：(1)仿生配基7肽的筛选；(2)噬菌体及其所展示的7肽配基通过交联剂戊二醛，以氨基乙醇-HCL为猝灭剂制备出交联噬菌体7肽亲和吸附介质CAPOP；(3)交联噬菌体7肽亲和吸附介质，以TBS/NaCl为洗脱剂，采用离心沉淀的方式，离心纯化菠萝蛋白酶；(4)菠萝蛋白酶的酶活以及含量测定。本发明工艺简单，成本低廉，重复性好；所筛选的7肽配基能够特异性识别菠萝蛋白酶，以此作为亲和色谱配基能够体现高效性和专一性；分离方法操作简单，快速、高效、分离量大，纯化倍数和酶活性较高，具有良好的应用前景。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 亲和 吸附 介质 纯化 菠萝 蛋白酶 方法 | ||
【主权项】：
一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，包括：(1)将酶标板包被加入菠萝蛋白酶溶液孵育，洗涤后加满封阻液，再次洗涤后加入噬菌体7肽文库孵育；用20～100μg/ml菠萝蛋白酶分子TBS洗脱液洗脱并感染10～20ml大肠杆菌ER2738菌液进行扩增8～14h，将菌液离心沉淀后取上清液，加入体积比为1∶3～1∶6的聚乙二醇PEG和NaCl溶液，冰置1～2h，8000～12000rpm离心沉淀10～20min，取上清液，重新悬浮于1～2ml TBS溶液，制得噬菌体TBS溶液；(2)将上述制备的0.1～1ml噬菌体TBS溶液加入到120～180μl戊二醛溶液中混合均匀，加入120～180μl PEG 6000震荡12‑24h，之后加入5～10ml氨基乙醇‑HCL，再加1～2ml NaCl溶液，室温震荡1～2h，8000～15000rpm离心沉淀，用TBS溶液洗涤，取上清液，于0～4℃保存，得交联噬菌体7肽亲和吸附介质；(3)将上述制备的0.01～0.1g交联噬菌体7肽亲和吸附介质溶于体积百分比为0.01～0.02％的NaN3TBS溶液中，加入10～20ml浓度为4～20mg/ml的菠萝蛋白酶溶液吸附2～4h，8000～15000rpm离心沉淀，用TBST清洗，以TBS/NaCl缓冲液为洗脱剂，洗脱被吸附的菠萝蛋白酶；(4)测试分离后的菠萝蛋白酶活性和菠萝蛋白酶含量。
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