[发明专利]一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法

摘要

一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法，是将携带表达载体的根癌农杆菌在含卡那霉素的LB液体培养基中培养16小时后备用；将平邑甜茶组培苗在继代培养基上培养35天，取伸展叶片剪成叶盘，置备用培养物中5分钟，后接种在再生培养基上暗培养1天；将叶盘转接在含头孢霉素的分化培养基上，(25±1)℃下暗培养14天，后置光周期16小时光照/8小时黑暗、光照强度30μmol·m-2·s-1下培养30天，将获得的不定芽切下，接种在生根培养基上，置光周期16小时光照/8小时黑暗、光照强度30μmol·m-2·s-1下培养40天生根；42℃下热处理15分钟，进一步鉴定后获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株。

主权项

一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法，其特征在于，步骤如下：A.构建植物表达载体p121‑Cre‑Gus，转化根癌农杆菌LBA4404，在28℃下在含100mg·L‑1卡那霉素的LB液体培养基中培养16小时；B.将平邑甜茶的组织培养苗在继代培养基上培养35天，之后在无菌条件下取组织培养伸展叶片，剪成面积约0.1cm2的叶盘，放在步骤A得到的培养物中5分钟，然后接种在再生培养基上，黑暗条件培养下1天；C.将经过步骤B培养的平邑甜茶叶盘转接在含300mg·L‑1头孢霉素的分化培养基上，在温度(25±1)℃下暗培养14天，然后置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m‑2·s‑1的条件下再培养30天，获得转化芽；D.将步骤C中获得的转化芽切下，接种在生根培养基上，置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m‑2·s‑1的条件下培养40天，即可完成生根；E.取步骤D中得到的转基因植株的幼叶进行PCR和GUS鉴定；F.将步骤D中得到的转基因植株置于42℃下热处理15分钟，再取其幼叶进行进一步PCR鉴定，获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株；所述植物表达载体p121‑Cre‑Gus的序列如序列表SEQ ID：No.1所示；所述继代培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L‑1蔗糖、6.5mg·L‑1琼脂粉、0.3mg·L‑16‑苄基腺嘌呤和0.1mg·L‑1萘乙酸，pH5.6的培养基；所述再生培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L‑1蔗糖、6.5mg·L‑1琼脂粉、2.0mg·L‑1N‑苯基‑N’‑1，2，3‑噻二唑‑5‑脲和0.2mg·L‑1吲哚丁酸，pH5.6的培养基；所述分化培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L‑1蔗糖、6.5mg·L‑1琼脂粉、300mg·L‑1头孢霉素、5mg·L‑1卡那霉素、2.0mg·L‑1N‑苯基‑N’‑1，2，3‑噻二唑‑5‑脲和0.2mg·L‑1吲哚丁酸，pH5.6的培养基；所述生根培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L‑1蔗糖、6.5mg·L‑1琼脂粉和0.4mg·L‑1吲哚丁酸，pH5.6的培养基。