[发明专利]基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用

摘要

本发明公开了一种基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用。本发明设计出用于检测α、β地中海贫血基因缺陷类型的探针，这些探针分别与不同颜色的荧光编码微球交联、混合后得到诊断α、β地中海贫血的液相芯片。本发明通过用本发明的特异性引物对待检样品进行PCR扩增后，得到生物素标记的PCR产物，然后将其与本发明的液相芯片进行杂交，再用藻红蛋白进行荧光标记，最后通过液相芯片检测仪读出检测结果。本发明所述的试剂盒包括PCR引物和特异性探针，能同时检测缺失型和非缺失点突变型α、β地中海贫血，可以极大地缩短临床地中海贫血的诊断时间，提高诊断效率和诊断准确性，且通量高，市场潜力大。

主权项

一种基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)设计PCR引物和探针序列，在与探针互补的链的PCR引物的5’端进行生物素修饰：PCR引物序列如下：SEA For：5’ AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC 3’；SEA Rev：5’ CCAAGCCCACGTTGTGTTCATG 3’；α3.7 For：5’ CCCCTCGCCAAGTCCACC 3’；α3.7 Rev：5’ TCAAAGCACTCTAGGGTCCAGC 3’；α4.2 For：5’ CAGTTTACCCATGTGGTGCCT 3’；α4.2 Rev：5’ CCCGTTGGATCTTCTCATTTCC 3’；α2 For：5’ CACAGTGAACCACGACCTCTA 3’；α2 Rev：5’ CACAGAAGCCAGGAACTTGTC 3’；α M For：5’ CTCTTCTCTGCACAGCTCCTAA 3’；α M Rev：5’ CTGCCCACTCAGACTTTATTCAAA 3’；β M1 For：5’ CCAATCTACTCCCAGGAGCAG 3’；β M1 Rev：5’ TGAGGTTGTCCAGGTGAGC 3’；β M2 For：5’ CCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAAT 3’；β M2 Rev：5’ GCAGAATGGTAGCTGGATTGTAG 3’；探针序列如下，探针5’末端进行Aminolinker C12修饰：α mut 1(N)：5’ GCGGTGCACGCCTCCC 3’；α mut 1(M)：5’ TGCGGTGCAGGCCTCCC 3’；α mut 2(N)：5’ CACGCCTCCCTGGACAAGTTC 3’；α mut 2(M)：5’ CACGCCTCCCCGGACAAGTT 3’；α mut 3(N)：5’ GCAAATACCGTTAAGCTGGAGCC 3’；α mut 3(M)：5’ GCAAATACCGTCAAGCTGGAGC 3’；α del SEA：5’ TGACGCTGTCTGCTTAAGGCCC 3’；α del 4.2：5’ CATGCCTGTAAACCCACCTACT 3’；α del 3.7：5’ TGGAGGAGGGAAAGTGGAGCCA 3’；α2：5’ CCGCGCAGGCCCCGCCCGGGAC 3’；β mut 1(N)：5’ CAGGGCTGGGCATAAAAGTCA 3’；β mut 1(M)：5’ CCAGGGCTGGGAATAAAAGTCA 3’；β mut 2(N)：5’ GGGCTGGGCATAAAAGTCAGG 3’；β mut 2(M)：5’ GGCTGGGCACAAAAGTCAGG 3’；β mut 3(N)：5’ GGCTGGGCATAAAAGTCAGGG 3’；β mut 3(M)：5’ GCTGGGCATGAAAGTCAGGG 3’；β mut 4(N)：5’ GCTGGGCATAAAAGTCAGGGC 3’；β mut 4(M)：5’ CTGGGCATAGAAGTCAGGGCA 3’；β mut 5(N)：5’ CTAGCAACCTCAAACAGACACCA 3’；β mut 5(M)：5’ CACTAGCAACCTCAGACACCATG 3’；β mut 6(N)：5’ ACAGACACCATGGTGCATCTG 3’；β mut 6(M)：5’ ACAGACACCAGGGTGCATCT 3’；β mut 7(N)：5’ TACTGCCCTGTGGGGCAAG 3’；β mut 7(M)：5’ TACTGCCCTGGTGGGGCA 3’；β mut 8(N)：5’ CTGTGGGGCAAGGTGAACG 3’；β mut 8(M)：5’ CTGTGGGGCTAGGTGAACG 3’；β mut 9(N)：5’ AGTTGGTGGTGAGGCCCTG 3’；β mut 9(M)：5’ AGTTGGTGGTAAGGCCCTGG 3’；β mut 10(N)：5’ GTGGTGAGGCCCTGGGC 3’；β mut 10(M)：5’ TGGTGAGGCCCCTGGGC 3’；β mut 11(N)：5’ CCCTGGGCAGGTTGGTATCAA 3’；β mut 11(M)：5’ CCCTGGGCAGTTTGGTATCAAG 3’；β mut 12(N)：5’ TGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTA 3’；β mut 12(M)：5’ TGGGCAGGTTGCTATCAAGGTTA 3’；β mut 13(N)：5’ ACCCTTAGGCTGCTGGTGG 3’；β mut 13(M)：5’ CACCCTTAGGTGCTGGTGGT 3’；β mut 14(N)：5’ ACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTT 3’；β mut 14(M)：5’ GGACCCAGAGGTTGAGTCCTTT 3’；β mut 15(N)：5’ GAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGG 3’；β mut 15(M)：5’ GAGGTTCTTTTAGTCCTTTGGGGA 3’；β mut 16(N)：5’ CGGTGCCTTTAGTGATGGCC 3’；β mut 16(M)：5’ CGGTGCCTTTAAGTGATGGCC 3’；β mut 17(N)：5’ CTGGGTTAAGGCAATAGCAATATC 3’；β mut 17(M)：5’ CTGGGTTAAGGTAATAGCAATATCTC 3’；N表示正常探针，M表示突变探针；(2)液相芯片的制备：将荧光编码微球与步骤(1)中所述的探针分别偶联，然后根据检测目的将偶联好探针的荧光编码微球混合，得到液相芯片；(3)标本检测：从标本中提取基因组DNA，根据检测目的选择步骤(1)中所述的PCR引物分别进行缺失型突变的α珠蛋白基因片段和非缺失型突变的α、β珠蛋白基因片段扩增，分别得到缺失型突变的α珠蛋白基因片段的PCR扩增产物和非缺失型突变的α、β珠蛋白基因片段的PCR扩增产物；接着将两种PCR扩增产物混合后与步骤(2)得到的液相芯片进行杂交，得到杂交产物；再用藻红蛋白对杂交产物进行标记，通过液相芯片检测仪读出检测结果。