[发明专利]一种利用基因工程菌生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法

摘要

本发明公开了一种利用TOP10/PBAD/Thio-TOPO-Arg-Bsub大肠杆菌基因工程菌生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法，该菌株能够表达产生超量的枯草芽孢杆菌精氨酸酶，高效的转化L-精氨酸成为L-鸟氨酸。

主权项

一种利用大肠杆菌TOP10/PBAD/Thio‑TOPO‑Arg‑Bsub基因工程菌生产L‑鸟氨酸盐酸盐的方法，该大肠杆菌基因工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC No.M2010358；生产方法包括如下步骤：(1)、将低温保存的大肠杆菌E.coli TOP10/pBAD/Thio‑TOPO‑arg‑Bsub基因工程菌株在含有100μg/ml Amp的平板上划线，37℃倒置培养，得到单菌落；(2).将Amp平板上长出的单菌落接种到含有100μg/ml的Amp的3.5ml LB培养基的试管中，37℃、225r/min，振荡培养过夜，12～16小时，得到一级种液。(3).取培养好的一级种液9ml接种到装有100ml 2％的玉米浆培养基的摇瓶中，37℃、225r/min，振荡培养8小时，OD＝3，得到二级种液。；(4).取培养好的二级种液1.2L接种到30L 4％的玉米浆培养基中，发酵温度控制在37℃，培养过程中补加600ml灭菌甘油，整个发酵过程中，用浓氨水调pH7.0～8.0，调整搅拌速度和空气流量，使溶氧量不低于20％，当细菌生长至OD600＝6.0，12小时，降温至30℃，并加入3g L‑Ara进行诱导，诱导8小时停止发酵培养，收集湿菌体；(5).将发酵好的菌液在4℃，5000r/min，离心10min，弃上清，收集菌体；(6).按菌∶精氨酸＝0.6∶10的比例，向100升pH9.0的15％的精氨酸底物溶液中加入湿菌体900克，把溶液中Mn2+浓度调整为10μmol/L，温度38℃酶解转化。转化18小时后，点薄板检测精氨酸酶解情况，精氨酸转化率≥98％时，进入下一工序；其中薄层层析所用的展层剂配比为：正丁醇∶丙酮∶浓氨水∶水＝10∶10∶5∶2。(7).用6M盐酸将酶解液pH调到5.0左右，60℃，保温30min；按底物量的15％加入活性炭，60℃，脱色30min后，过滤至清亮；(8).滤液在0.08Mpa以上的真空下浓缩至底物量的2.5～3倍体积；(9)再按底物量的8％加活性炭，60℃，脱色30min后，过滤至清亮；(10)继续减压浓缩至底物量的1.5倍的体积，加入一倍体积的95％的乙醇，冷却后，第一批L‑鸟氨酸盐酸盐结晶析出。用第一次结晶产物湿重的一半数量体积的85％的乙醇洗涤结晶产物两次并甩干，烘干得产品，洗涤液和母液合并用于进一步回收L‑鸟氨酸盐酸盐产品。