[发明专利]通过超量表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法

摘要

本发明涉及通过超量表达comA基因提高枯草杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC9943为出发菌株，以整合载体pDK为骨架构建一个基因超量表达载体pDK-ComA，利用同源重组原理，通过双交换过程将comA基因整合到枯草芽孢杆菌ATCC9943基因组的方法构建了一个高产抗菌肽菌株FMB27。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产surfactin和fengycin的能力大大提高。

主权项

通过超量表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于：（1）comA基因整合载体pDK‑ComA的构建设计引物EM‑F和EM‑R，以pMUTIN4质粒DNA为模板PCR扩增红霉素抗性基因EM，获得850 bp基因片段；设计引物ComA‑F和ComA‑R，以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增comA基因，获得645 bp基因片段；扩增得到的两个基因分别克隆至pMD19‑T载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为pEM‑T、pComA‑T，于‑20℃条件下保存备用；名称序列酶切位点ComA‑F5’CCGGAATTCATGACCAGTCAGTCAATAAAAAATG3’EcoRIComA‑R5’GCGGGATCCTTACTCTTCTTCCGTTCCCGG3’BamHIEM‑F5’CGATACGTATGATAGGTGGTATGTTTTCGC3’SnaBIEM‑R5’AAAAGTACTCATGTGTACATTCCTCTCTT3’SacIpDK用snaBI/SalI双酶切后获得的大片段，与经过相同双酶切处理的pMUTIN4载体后获得的包括Pspac启动子和多克隆位点MCS的片段，用T4  DNA连接酶连接，构建pDK‑Pspac载体，酶切验证正确后于‑20℃条件下保存备用；pDK‑Pspac用SnaBI/sacI双酶切后获得的大片段，与经过相同双酶切处理的pEM‑T载体后获得的EM基因片段，用T4 DNA连接酶连接，构建pDK‑Pspac‑EM载体，酶切验证正确后于‑20℃条件下保存备用；pComA‑T用BamHI/EcoRI酶切后获得comA片段，与经过相同酶切处理的pDK‑Pspac‑EM载体，用T4 DNA连接酶连接，构建comA基因超量表达载体pDK‑ComA，酶切验证正确后，转化大肠杆菌DH5a，用于下一步转化；（2）FMB 27突变菌株的构建以枯草芽孢杆菌ATCC 9943制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的comA基因超量表达载体pDK‑ComA转化入枯草芽孢杆菌ATCC 9943，在基因组amyE位点发生双交换，红霉素平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为FMB 27；该菌株的amyE基因被Pspac‑ComA基因所取代，成为超量表达comA基因的突变菌株，即为所得到的菌株。