[发明专利]用于直接表达肽的改进的细菌宿主细胞

摘要

本发明涉及用于直接表达肽的改进的细菌宿主细胞。本发明还涉及表达系统，用于将产物直接表达到遗传工程化宿主细胞所生长的培养基中。用特殊选择的宿主和/或发酵工艺获得了高产量，发酵工艺包括小心控制细胞生长速度、在生长速度期间使用诱导物以及在生长阶段期间使用诱导物。提供了用于制备表达载体的特殊的通用克隆载体，其包括具有可操作地与编码信号肽的编码区连接的多个启动子的控制区，该信号肽编码区位于编码所感兴趣的肽的编码区的上游。也使用多种转录盒来增加产量。也公开了使用表达系统来生产酰胺化的肽。

主权项

制备包含多个转录盒的表达载体的方法，每个盒包括：(1)带有编码肽产物的核酸的编码区，其符合读码框地连接到编码信号肽的核酸3′；以及(2)可操作地与编码区连接的控制区，所述控制区包括多个启动子，所述方法包括：(a)使用两个基因克隆酶限制位点将所述带有编码肽产物的核酸的编码区符合读码框地克隆到克隆载体中编码信号肽的核酸的3′，从而形成克隆载体中的表达盒，其中所述克隆载体包括(i)包括至少两个启动子的控制区；(ii)编码信号序列的核酸；(iii)两个基因克隆酶限制位点，其允许克隆符合所述信号序列读码框的编码肽的基因，并与所述控制区可操作地连接；(iv)至少两个盒克隆酶限制位点，其位于所述基因克隆酶限制位点的3′；以及(v)至少两个盒克隆酶限制位点，妻位于所述控制区的5′，其中所有所述的限制酶位点互不相同，并在所述载体中是独特的；(b)使用在所述基因克隆酶限制位点3′的盒克隆酶限制位点处切割的第一限制酶和在所述基因克隆酶限制位点5′的盒克隆酶限制位点处切割的第二限制酶将表达盒从克隆载体上切割下来；(c)将表达盒连接到含有步骤(b)的盒克隆酶限制位点的模板表达载体中，这样第一限制酶位点就在第二限制酶位点的3′，其中所述模板表达载体：(i)已经用第一和第二限制酶连接，以及(ii)至少再另外含有一对盒克隆酶限制位点，例如所述位点对的第一成员与步骤(a)的位于所述基因克隆酶限制位点3′的盒克隆酶限制位点相同，而所述位点对的第二成员与步骤(a)的位于所述基因克隆酶限制位点5′的盒克隆酶限制位点相同，其中所述位点对的第一成员在所述位点对的第二成员3′，每个盒克隆酶限制位点是模板载体上独特的，没有其它的步骤(a)的盒克隆酶限制位点落在第一盒克隆酶限制位点的5′和第二盒克隆酶限制位点的3′的区域中，或者落在盒克隆酶限制位点对第一成员5′的和盒克隆酶限制位点对第二成员3′的区域中；以及(d)至少重复一次步骤(b)和(c)，但是使用切割任一盒克隆酶限制位点对的第一成员和第二成员的限制酶，而不是步骤(b)的第一和第二限制酶。