[发明专利]香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法

摘要

本发明公开了一种香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，本发明经过大量实验筛选，首先高效地将香蒲假茎中的蛋白质提取出来，然后在优选条件下，采用双向电泳方法将蛋白质各成分和次生代谢物（如：色素、酚类、醌类等）成分进行分离，然后采用优选条件的硝酸银染色法进行定性分析和/或采用质谱仪对分离的蛋白质进行定性和定量分析。实验结果表明，本发明采用的双向电泳分析方法分离得到的蛋白点多，经PDQuest图像分析软件检测，蛋白点多于1000个，且图谱清晰，无横向、纵向条纹，该方法重复性和稳定性好，能方便鉴别香蒲这一药食两用植物的真伪，为对香蒲进行深入研究，为实现科学化种植、培育和开发利用提供质控标准和科学依据。

主权项

1.香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，其特征在于包括以下步骤：(1)采集香蒲假茎，用超纯水洗净，并用滤纸吸去多余水分，放入液氮中速冻，并移至-80℃冰箱保存备用；(2)称取5g步骤(1)保藏的香蒲假茎迅速放入冰浴的研钵中，加液氮研磨成细粉，研磨过程中加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮，把研磨后的细粉转入-20℃预冷的50ml离心管中，加入3倍体积-20℃预冷的三氯乙酸/丙酮溶液，充分混合后，放在-20℃冰箱中静置2小时，备用；(3)取步骤(2)得到的香蒲假茎细粉的三氯乙酸/丙酮溶液，在35000 转/分钟，4℃离心30min，移去上清液，取沉淀，加入25ml预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000 转/分钟，4℃离心 30min，移去上清液，取沉淀，再加入25 ml -20℃预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，去掉上清液后，用滤纸将离心管封口，真空冷冻干燥，得到香蒲假茎蛋白粉；备用； (4)取步骤(3)得到的香蒲假茎蛋白粉在4℃溶于样品裂解液中1 小时，期间在裂解液中加玻璃珠，并用超声波超声三次，每次3分钟；然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，得到上清液；然后用3倍体积预冷的样品洗涤液在-20℃沉淀1小时，然后再在35000转/分钟，4℃、离心30min，弃上清液，得离心沉淀后溶解于样品裂解液，在4℃溶解1小时，然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，取上清液，得到香蒲假茎蛋白质提取液，备用；(5)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液，采用考马斯亮兰法测定其蛋白浓度，对蛋白质进行定量；(6)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液进行电泳分析:第一向等电聚焦电泳：按上样量500μg，上样体积450μl, 用水化液对已定量好的香蒲假茎蛋白样品进行稀释；将香蒲假茎蛋白样品加入水化盘内后，再将线性IPG胶条胶面向下放入水化盘中，除去胶面与蛋白样品液间的气泡，每个胶条用7ml矿物油覆盖胶条，进行水化；水化结束后进行等电聚焦；(7)胶条平衡处理：将步骤(6)等电聚焦完成后的IPG胶条进行平衡2次，每次平衡时间为15min，二次平衡缓冲液的配制分别如下：胶条平衡缓冲液母液组成：6mol/L的尿素，质量体积比2%的十二烷基磺酸钠，0.375mol/L的Tris-HCl，体积比30%甘油，溶剂为水；第一次胶条平衡缓冲液为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入20mg 二硫苏糖醇；第二次胶条平衡缓冲液为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入25mg碘乙酰胺；第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳：将平衡后的胶条置于胶浓度为12.5%的SDS-PAGE凝胶上，用浓度为0.5%低熔点琼脂糖的封胶液封住顶部，其中琼脂糖中含有质量体积比为0.002%的溴酚蓝，然后按如下参数进行电泳：16℃恒温，恒功率条件下，用2瓦/根胶条电泳1.5h，再用12瓦/根胶条电泳4~6h，直到溴酚蓝移动到需要的位置为止；(8)电泳结束后对蛋白采用硝酸银法进行染色分析或对蛋白质进行质谱检测和分析。