[发明专利]一种检测磷脂依赖性凝血因子X激活物酶活性的方法

摘要

本发明公开了一种快速、特异性地测定磷脂依赖性凝血因子X激活物酶活性的方法，采用生色底物法，使用酶标仪，在一定反应时间和一定活力的标准品范围内获得线性反应曲线，建立产物吸光值和磷脂依赖性凝血因子X激活物浓度的线性关系，据此计算样品的相应酶活。此外，还对该标准曲线的回收率和精密度做了仔细研究，该方法准确度高，步骤简单，方便实验室操作，适用于X激活物原料及蛇毒血凝酶制剂的质量控制。

主权项

一种检测磷脂依赖性凝血因子X激活物(FXA)酶活性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)配制pH＝7.4，浓度为0.02M的Tris‑HCl缓冲液；(2)配制浓度为0.075M的CaCl2溶液；(3)用10ml(1)步制备的缓冲液将10mg人血清白蛋白配制成浓度为1mg/ml血清白蛋白稀释液；(4)FXA生色底物S‑2765与(1)步制备的缓冲液和(2)步制备的CaCl2溶液混合，配制成溶液A；(5)用(1)步制备的缓冲液将Human Factor X稀释成溶液B；(6)用(1)步制备的缓冲液和(3)步制备的血清白蛋白稀释液将已知浓度的FXA单体标准品稀释成一系列不同浓度的母液Cn(n≥1)；(7)用(1)步制备的缓冲液和(3)步制备的血清白蛋白稀释液将待测样品稀释成溶液Dn(n≥1)；(8)将相同体积的一系列不同浓度标准品母液C1、C2、C3......Cn(n≥1)与待测样品溶液Dn分别加到酶标板不同孔中，再向每孔中补充相同体积的溶液A和相同体积的溶液B，保持每孔溶液的总体积一致，把孔内溶液混匀，立即放入预热至37℃的酶标仪中反应，分别测定每孔中酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，并根据测定得到的不同浓度标准品母液吸光度A405值，绘制FXA单体标准品的浓度‑吸光度线性标准曲线；(9)将测定得到的待测样品Dn的吸光度A405值，代入(8)步得到的PNA标准曲线，确定待测样品的酶浓度和活性。