[发明专利]一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法

摘要

本发明提供了一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法。该方法包括以下步骤：合成目的基因HSP70；将基因与质粒载体分别用EcoRI与XhoI进行双酶切后连接转化感受态细胞DH5α，提取重组质粒后转化感受态细胞BL21，诱导表达目的蛋白，然后纯化。该纯化后的蛋白可以用来免疫小鼠以制备相应的单克隆抗体。

主权项

一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法，其特征在于包括如下步骤：(1)目的基因HSP70的合成；(2)分别双酶切HSP70基因与载体，连接构建重组质粒，转化宿主菌，构建HSP70基因工程菌；(3)培养HSP70基因工程菌，诱导表达目的蛋白；(4)纯化所得融合蛋白；其中，上述步骤(1)所述的目的基因的合成为：设计上游引物CGGAATTCCACGGCAAGGTGGAGA下游引物为CCCTCGAGTTACTGCGAGTCGTTGAAGTA。从Hela细胞系中提取总RNA进行逆转录后所得cDNA为模板进行PCR反应，PCR扩增条件为：94℃预变性8min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃后延伸8min。上述步骤(2)所述载体为pET32a及pGEX‑4T‑1，所用的限制性内切酶为EcoRI和XhoI，所用宿主菌为大肠杆菌。上述步骤(3)所述的培养工程菌的培养基为LB液体培养基，诱导温度为30℃，诱导时间为4h。上述步骤(4)所述的纯化方法为将诱导后的菌液分装在离心管中4℃离心，2164g，10min。用PBS缓冲液重悬加入蛋白酶抑制剂(PMSF)后反复冻融8次，进行超声处理至SDS‑PAGE显示沉淀中蛋白纯度＞80％。将沉淀最后用6M尿素溶解。