[发明专利]模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体及其皮肤替代物

摘要

本发明涉及组织工程和医学创面修复技术领域，是一种可在体外模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体及其皮肤替代物。本发明利用医学废弃的人羊膜作为基质材料，采用反复冻融结合DNA酶消化法去除羊膜细胞，进一步通过冷冻裂解制备了200-500μm大小的具有三维立体结构的羊膜微载体，其不仅具备一般微载体的特性，而且保留了基底膜结构，具有较为完整的IV型胶原、层粘连蛋白，同时含有NGF、HGF、KGF、bFGF、TGF-β1、EGF等生长因子，为表皮干细胞的体外培养扩增提供了近似生理的niche微环境，可在保持干细胞特性的同时快速扩增表皮干细胞，此外其可直接作为真皮支架构建皮肤替代物，动物全层皮肤缺损移植实验显示，愈合质量远优于单纯的羊膜微载体组和空白对照组，不仅新生表皮层明显增厚，伴有乳突样结构形成，而且新生真皮层胶原纤维排列规则、有序。

主权项

模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体，构建方法如下：1)羊膜的获取按常规取废弃健康新鲜的胎盘组织，在无菌条件下剥离羊膜，钝性分离绒毛膜，经含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素的PBS浸泡冲洗3×15min，将羊膜切割成3×2cm大小的小片，放入冷冻管中，加入含10％DMSO的PBS，将冷冻管置‑80℃冰箱保存备用；2)羊膜去细胞化处理取出上述冷冻管，置25℃水浴充分解冻，吸出羊膜中的PBS，再将冷冻管放置于液氮中冷冻，如此解冻和冷冻反复冻融3次，然后将羊膜孵育在1mg/mlDNAase中酶解，37℃条件下孵育3小时伴轻微震荡，室温下离心去除上清液，按常规用PBS充分冲洗羊膜后冻干，成片状羊膜；3)制备羊膜微载体将上述片状羊膜迅速置于液氮中，通过均质化冷冻裂解，将片状羊膜裂解成羊膜微粒，然后在真空密闭条件下冷冻干燥，将羊膜微粒依次通过32目、80目金属筛网过滤，获得200‑500μm的羊膜微载体。