[发明专利]一种快速高效的籼稻转基因方法

摘要

本发明公开了一种快速高效的籼稻转基因方法，该方法包括以诱导愈伤组织5-10天后的籼稻成熟种子用于农杆菌浸染，共培养后经过10-20天抗性愈伤组织的筛选和10-20天的分化培养，以及5-10天的生根培养和二次抗性筛选等过程，在40-50天内即可获得籼稻转化植株，转化效率达20-30％。转化过程中的培养条件除了共培养阶段为25℃暗培养外，其余均为30-33℃高温和光照强度为80-120μmole m-2 s-1的持续光照条件。本发明方法极大地缩短了愈伤组织的离体培养时间，获得了较高的分化效率，同时也降低了体细胞的突变频率，简化了操作程序，节约了大量人力和物力。

主权项

一种水稻转基因的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)愈伤组织的诱导将水稻种子接种于诱导培养基中，培养条件为30‑33℃，持续光照，培养至种子胚的盾片处诱导出愈伤组织；(2)载体的选择和农杆菌的准备将含有目的基因的表达载体转入农杆菌，选取阳性菌株，再将阳性菌株进行培养，然后将培养后的农杆菌震荡悬浮于含有浸染培养基的离心管中，作为愈伤组织的农杆菌浸染液；其中，所述表达载体还含有抗性基因，或者含有抗性基因和红色荧光蛋白基因；(3)愈伤组织和农杆菌的共培养将第(1)步诱导出愈伤组织的种子，浸泡于第(2)步得到的农杆菌浸染液，然后将浸染后的种子吸干，置于共培养基上于22‑28℃黑暗培养2‑5天；(4)农杆菌的洗脱：洗涤共培养后的种子；(5)抗性愈伤组织的筛选首先进行愈伤组织的抗性筛选，将洗脱后的种子置于含有相应筛选剂的筛选培养基上，于30‑33℃和持续光照条件下筛选培养10‑20天，每7‑10天继代一次；若第(2)中的表达载体含有红色荧光蛋白基因，则进一步进行愈伤组织的RFP筛选，将抗性筛选10‑20天后的抗性愈伤组织置于绿光激发装置下，透过红色滤光膜筛选含RFP的愈伤组织用于后续的分化培养；(6)抗性愈伤组织的分化将筛选出的愈伤组织转移至不含抗生素的分化培养基上，于30‑33℃和持续光照条件下进行分化培养10‑20天，得到再生植株；(7)再生植株的生根和二次抗性筛选若第(5)步中只进行了愈伤组织的抗性筛选，则将再生植株移栽于含有筛选剂的生根培养基中，于30‑33℃和持续光照条件下进行二次抗性筛选和生根培养5‑10天，获得再生苗；若第(5)步中进行了愈伤组织的抗性筛选和RFP筛选，则将再生植株移栽于不含有8筛选剂的生根培养基中，于30‑33℃和持续光照条件下进行生根培养5‑10天，获得再生苗；(8)炼苗和移栽将再生苗洗去培养基，然后移栽至培养土中，于30‑33℃持续光照的培养室中炼苗3‑5天。