[发明专利]一种去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b的制备方法

摘要

本发明属于干扰素的制备领域，具体涉及一种去甲硫氨酸重组人干扰素-α2b的制备方法。本制备方法设计引物扩增甲硫氨酸氨基肽酶基因片段，将其克隆至表达质粒pACYCDuct-1中，获得重组表达质粒pACYCDuct-1-MetAP，再将其导入含有人干扰素-α2b基因的重组表达质粒pJW2-rhIFN-α2b的BL21细胞中，利用0.1μM??IPTG诱导甲硫氨酸氨基肽酶表达，42℃诱导人干扰素-α2b蛋白表达，在表达过程中切除人干扰素-α2b蛋白N端的甲硫氨酸(Met)。本制备方法能够去除人干扰素-α2b的N端的非必要Met残基，提高人干扰素-α2b的稳定性和抗病毒活性，降低其免疫原性，减少患者使用人干扰素-α2b时的不良反应发生率。

主权项

一种去甲硫氨酸重组人干扰素 α2b的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)、重组人干扰素 α2b表达载体的构建：设计上下游引物P1和P2，其中P1：GGCATATGTGTGATCTGCCTCAAACCCACP2：GGGGATCCTTATTCCTTACTTCTTAAACTTTC以人干扰素 α2b基因为模板，并用P1和P2引物通过PCR扩增法获得人干扰素 α2b基因片段，将PCR产物经过Nde I和BamH I双酶切插入原核表达载体pJW 2的Nde I和BamH I的酶切位点，所述原核表达载体pJW 2含有PRPL串联启动子，再转化至E.coli BL21感受态细胞，以获得含有重组表达载体pJW 2 rhIFN α2b的E.coli BL21细胞；(2)、pACYCDuct 1 MetAP表达载体的构建：设计上下游引物P3和P4，其中P3：GCCCATGGGCTATCTCAATCAAGACCP4：CGGGATCCTTATTCGTCGTGCGAGATTAT以甲硫氨酸氨基肽酶(MetAP)基因蛋白质编码区为模板，并用P3和P4引物通过PCR扩增法得到MetAP基因片段，将PCR产物MetAP经过Nco I和BamH I双酶切插入原核表达载体pACYCDuct 1的Nco I和BamH I的酶切位点，获得重组质粒pACYCDuct 1 MetAP；(3)、将(2)步骤中获得的重组质粒pACYCDuct 1 MetAP转化至含有重组表达载体pJW2 rhIFN α2b的E.coli BL21感受态细胞，筛选出高效表达的阳性克隆菌，获得含有双质粒的重组表达菌株MetAP pJW2 rhIFN α2b，诱导表达并提取、复性和纯化，最终得到去甲硫氨酸重组人干扰素 α2b。