[发明专利]用于去除所选择DNA序列的方法和手段

摘要

本发明描述用于使用处于小孢子特异性启动子控制下表达切点罕见双链断裂诱导DNA内切核酸酶通过在两个同向重复DNA序列间的染色体内重组而从DNA分子内精确去除所选择亚片段的方法。本方法可以应用于用来将植物细胞和植物内的靶DNA片段精确交换成目的DNA片段的方法内。

主权项

用于将植物基因组内的靶DNA序列交换成目的DNA序列的方法，包括如下步骤：a.在植物细胞基因组内预先选择位点处诱导第一个双链DNA断裂，所述预先选择位点位于所述靶DNA序列内或位于所述靶DNA序列附近；b.将目的DNA分子导入所述的植物细胞，所述的DNA分子包含：i.位于两个侧翼DNA区域之间的所述目的DNA序列，其中所述的侧翼DNA区域与所述植物细胞基因组内所述靶DNA序列的侧翼DNA区域并且优选所述预先选择位点的侧翼DNA区域具有至少80％序列同源性；ii.位于所述侧翼DNA区域之间的选择标记基因或筛选标记基因，所述选择标记基因或筛选标记基因还位于侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的至少部分的所述侧翼DNA区域之一的另一拷贝之间，其中所述另一拷贝标示为部分侧翼DNA序列；iii.位于侧翼DNA区域之一与以同向重复方式存在的所述部分侧翼DNA区域之间的DSBI酶的识别位点；c.选择包含所述选择标记或筛选标记的植物细胞的群体；d.选择在其中所述选择标记或筛选标记已经借助所述侧翼DNA区域通过同源重组而导入的植物细胞并从所述植物细胞再生植物；e.将包含所述选择标记基因的所述再生植物或其后代植物与包含编码DSBI酶的嵌合基因的植物杂交，所述嵌合基因包含如下有效连接的DNA区段：iv.小孢子特异性启动子；v.编码可识别位于所述目的DNA内的所述识别位点的双链DNA断裂诱导酶的DNA区域；vi.转录终止和聚腺苷酸化区域；f.选择包含所述选择标记基因或筛选标记基因和编码DSBI酶的所述嵌合基因的后代植物(F1植物)；g.将所述的后代植物与另一植物杂交，由此使用所述后代植物作为花粉供体；h.选择包含编码DSBI酶的所述嵌合基因的后代植物的群体(F2群体)；和i.选择如此的后代植物，在所述后代植物中所述的选择标记基因或筛选标记基因通过在所述侧翼DNA区域之一与包含所述侧翼DNA区域之一的一部分的部分侧翼DNA区域之间的同源重组被缺失。