[发明专利]一种研究白酒发酵过程微生物群落多样性的方法

摘要

本发明涉及一种研究白酒发酵过程微生物群落多样性的方法，即末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术，属于微生物生态技术领域，主要步骤如下：1)以白酒发酵过程中的酒醅为样品，直接提取酒醅中总DNA；2)以总DNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板，利用通用引物扩增细菌16S??rDNA，其中正向引物5’端使用6-羧基二乙酸荧光素(FAM)标记；3)PCR产物纯化后，利用限制性内切酶消化；4)DNA测序仪检测带有荧光标记的末端限制性片段，得到不同发酵时间酒醅中微生物群落T-RFLP图谱。本发明是不依赖于传统方法的分子生物学技术，具有分辨率高、方便、准确的特点，能够快速反映白酒发酵过程中微生物群落动态变化规律，为揭示酿造过程微生物群落多样性和定性定量分析提供了技术依据。

主权项

一种研究白酒发酵过程微生物群落多样性的方法，其特征在于包含以下步骤：a)以某固态法白酒厂窖池发酵不同天数的酒醅为样品，取样后分别放置无菌离心管中， 20℃保存；b)取0.5～2.0g酒醅样品加2.0～6.0mL 1×PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/L NaH2PO4·7H2O，1.4mmol/LKH2PO4)缓冲液，10000rpm，4℃离心10min，收集沉淀，加入DNA提取液提取总DNA；c)以步骤b)中提取的总DNA为模板，利用通用引物27F和1492R进行PCR扩增，以获得细菌16S rDNA。其中正向引物27F的5’ 端用6 羧基二乙酸荧光素(FAM)标记；d)将步骤c)中得到PCR产物用纯化试剂盒按照使用说明进行纯化，纯化后利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测；e)将步骤d)中得到的纯化后的产物分别利用限制性内切酶Msp I和Rsa I消化，20μL中反应体系包括10×buffer 2μL，10μL PCR产物，Msp I或RsaI各10U(1μL)，加入灭菌双蒸水至20μL。37℃消化2h后65℃温育10min；f)酶切产物进行T RFLP分析，得到酒醅发酵过程T RFLP图谱，经数据处理，获知白酒发酵过程中微生物动态变化和消长规律。