[发明专利]从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法

摘要

本发明涉及从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法。本方法包括下述步骤：植物源材料的处理；乳酸菌的分离筛选；用菌株发酵上清液做抑菌试验的方法筛选产抑菌物质的乳酸菌菌株；通过用上清液的透析液做抑菌试验来排除小分子的干扰，筛选产细菌素的乳酸菌菌株，以及用硫酸铵沉淀后的蛋白粗提物做抑菌试验的方法和各种蛋白酶对粗提物的酶解实验的方法证明了利用该方法可以有效地筛选到产细菌素的乳酸菌菌株。本发明对产细菌素乳酸菌的分离纯化方法进行了改进，通过用截留分子量较小的透析袋透析处理发酵上清液，即可排除发酵上清液中的小分子抑菌物质对指示菌的抑制作用，同时又保证了细菌素的活力。本方法既减少了实验步骤，又提高了筛选效率。

主权项

一种从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)植物源材料的处理将植物源材料剪成小块后装入试管，或将植物源材料直接加入试管，向试管中加入适量无菌水，压实后密封，室温下富集10～15天，得到富集液；(2)乳酸菌的分离与纯化A、在无菌条件下，吸取0.1mL富集液，进行梯度稀释，得到10‑4、10‑5、10‑6、10‑7的梯度稀释液；B、取上述不同梯度的稀释液各0.05～0.2mL，分别加入到MRS固体平板上，并将菌悬液均匀涂布于平板表面；C、在25℃～35℃的无氧条件下，将上述平板静置培养1～5天；D、根据菌落形态的差异，用接种环挑取各种典型菌落，在另一MRS固体平板上进行四区划线，置于25℃～35℃的无氧条件中培养1～5天；E、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化；(3)产抑菌物质的乳酸菌的筛选A、将步骤(2)得到的完全纯化的菌株分别接入MRS液体培养基中，在25℃～35℃无氧条件下静置培养24～48h，得到菌株的发酵液；B、在4℃条件下，分别将上述发酵液经7000～10000r/min离心10～25min，保留上清液；C、通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株；(4)产细菌素乳酸菌的筛选将上述产抑菌物质的菌株的上清液用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析6～12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉；将冻干粉溶解在二级水中，浓度为20～200mg/mL，通过牛沣杯扩散法检测冻干粉制备的样品是否产生抑菌圈，并保存产细菌素的菌株；(5)产细菌素乳酸菌的验证将(4)中得到的产细菌素菌株的发酵上清液通过硫酸铵沉淀法进一步验证抑菌物质为细菌素。