[发明专利]一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法

摘要

本发明提供的一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法，用乳酸链球菌素作为抗原进行动物免疫得到多克隆抗体，以乳酸链球菌素半抗原与卵清蛋白ＯＶＡ的偶联物作为包被抗原，以乳酸链球菌素为标准品，建立免疫检测及对食品样品的处理方法，提供其方法的载体试剂盒。该检测方法的构建包括：对检测样品的处置；包被抗原的制备；多克隆抗体的制备及竞争反应；加酶标二抗、显色等。获得的检测试剂盒包括：包被原的酶标板1块；酶标二抗工作液1瓶；抗体工作液1瓶；乳酸链球菌素标准品溶液6瓶；底物显色液2瓶；终止液1瓶；浓缩洗涤液1瓶；复溶工作液1瓶。

主权项

一种食品防腐剂‑乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法，其特征在于：用乳酸链球菌素作为抗原进行动物免疫得到多克隆抗体，以乳酸链球菌素半抗原与卵清蛋白ＯＶＡ的偶联物作为包被抗原，以乳酸链球菌素为标准品，构建免疫检测及对样品的处置方法，即获取该方法的载体试剂盒；1）检测方法的构建：包被抗原的制备：用pH值为9.6 的0.01‑0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释包被抗原1000倍，加入酶标板，每孔100µl，37℃孵育2h，倾去包被液，用含有 0.05%0叠氮化钠、0.1%明胶和0.05%吐温的磷酸盐缓冲液，即0.02M、pH 7.4，洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150μl封闭液，即0.1%0叠氮化钠和10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存；多克隆抗体的制备：将1.0mg/ml的乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏佐剂混合均匀，对首次免疫的兔子实施颈背部皮下多点注射，每点0.2ml；第二次免疫，将1.0mg/ml乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀，对兔子实施颈背部皮下多点注射，每点0.2ml；每次注射间隔2周，采血检测抗血清效价，直到抗体效价大于1：3000为止；竞争反应：用0.1%牛血清白蛋白的0.03‑0.06mol/L的磷酸盐缓冲液，对乳酸链球菌素的标准品实施梯度稀释，其梯度为0.1、0.5、2.5、12.5、62.5µg/ml，每孔加50µl；将制备的多克隆抗体以2.5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液按1：1000比例稀释后加入，每孔加入50µl，37℃温育30min，然后用PBST洗涤3‑5次；加酶标二抗：将0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体以１：5000稀释后加入，每孔加入100µl，37℃，30min后，用PBST洗涤3‑5次；显色：每孔加入显色液100µl，37℃显色15min；最后每孔加入终止液２M硫酸溶液50μＬ；用酶标仪450nm测吸光值A450，与所作标准曲线对比算出待测样品的乳酸链球菌素的含量；上述乳酸链球菌素标准品购置于 sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体购置于 Jackson ImmnoResearch LABORATORIES,INC；2）对检测样品的处置：乳饮料：将0.1%牛血清白蛋白的0.03‑0.06mol/L磷酸盐缓冲液，即为复溶工作液，对样品处置，即稀释10倍；肉制品：将样品制成粉末状，取1g样品置于50ml离心管里，加入5ml的复溶工作液，充分震荡混匀，后静置10min，提取上清1‑2ml，用于分析。