[发明专利]一种利用抗氧化剂筛选牛核移植供体细胞的方法

摘要

本发明涉及动物生殖和分子生物学操作技术领域。具体涉及牛体细胞核移植中供体细胞的选择方法。公开了一种利用抗氧化剂筛选牛核移植供体细胞的方法。为了提高牛核移植效率中的供体细胞的数量，本发明利用活体采样，接种法培养细胞，稳定传代的活力为OD值为0.609±0.053的第六代细胞，用浓度为100μmol/L的β-巯基乙醇处理细胞24h后的细胞作为供体细胞，为重构胚更好的发育奠定了基础。

主权项

一种筛选牛核移植供体细胞的方法，其特征在于以下步骤：1)剪取牛耳尖端4‑5cm2的组织，利用接种法培养得到牛耳组织成纤维细胞；2)在步骤1)的细胞传至2、6、13、20代时分别测定细胞活力，即MTT OD值；3)挑选细胞活力OD值为0.609±0.053的第六代的细胞，备用；4)用浓度为100μmol/L的β‑巯基乙醇处理步骤所得的细胞24h的细胞作为供体细胞；5)取牛卵母细胞在成熟培养液中培养至成熟，备用；6)将步骤5)的牛卵母细胞作为受体，进行核移植，观察并记录重构胚的卵裂率和囊胚率；其中：上述试剂的组分及配制方法如下细胞培养液‑1和细胞培养液‑2；细胞培养液‑1：胎牛血清10ml，青霉素‑链霉素抗菌液1ml，用杜贝柯氏最小必需培养液定容至100ml；细胞培养液‑2：胎牛血清20ml，青霉素‑链霉素抗菌液1ml，用杜贝柯氏最小必需培养液定容至100ml；抗氧化剂培养液：向细胞培养液‑1中添加β‑巯基乙醇，其浓度分别为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、和150μmol/L，过滤除菌，4℃下保存；成熟培养液：TCM199 26ml；胎牛血清3.0ml；促卵泡激素15μg；促黄体素150ng；雌二醇30μg；表皮生长因子150ng；丙酮酸钠6.6mg；青霉素‑链霉素抗菌液0.3ml；过滤灭菌，4℃下保存；胚胎培养液：肌醇0.015g；必须氨基酸900μl；非必需氨基酸300μl；牛血清白蛋白0.09g；青霉素‑链霉素抗菌液300μl；丙酮酸盐600μl；Stock G30μl；Stock C28ml；过滤灭菌，4℃下保存；各种盐溶液的配制：Stock A：NaCl1.267g；KCl0.107g；KH2PO40.032g；MgSO4·7H2O0.036g；青霉素‑链霉素抗菌液0.2ml；Na‑Lactate0.12ml；H2O19.5ml；Stock B：NaHCO30.21g；H2O10ml；Stock D：CaCl2·2H2O0.262g；H2O10ml；Stock G：L‑Glucose0.292g；H2O10ml；Stock C：STOCK A1.1ml；STOCK B1.0ml；STOCK D0.1ml；H2O7.9ml。