[发明专利]一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法

摘要

本发明揭示了一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，包括根据细胞悬液在降温过程中的放热量与细胞体积的线性关系，确定细胞在恒定降温速度下在特定保存液中的体积变化，再根据水分跨膜转运的数理模型拟合红细胞对应的渗透参数，最后通过模拟细胞在不同降温速度下的体积变化来预测其对应的最佳降温速度范围。通过细胞计数仪测定细胞回收率论证得到：DSC法能较为准确地预测细胞在特定保存液中的最佳降温速度范围，大幅降低工作强度，便于指导并建立更为合理的低温保存方案。

主权项

1.一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：一、制备试样将新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜，再用0.9％NaCl溶液反复洗涤3次，弃去上清液，得到红细胞浓缩液备用；将二甲基亚砜DMSO按四步等体积法添加到红细胞浓缩液中，制备成压积为0.4，DMSO终浓度为20％的细胞悬液，两次添加间隙需将试样在室温下静置5min，随后添加0.5～1mg丁香假单胞菌，混匀后滴加至标准铝皿中，称重密封；二、DSC试验温度程序(1)测定保存液的熔融温度T_ph将试样移入DSC的样品炉腔中，盖好炉盖，将初始温度设定为4℃，随后将试样降温至-85℃，待热流稳定后从-85℃以10℃/min加热至20℃，用热分析软件Pyris Software 5.0采集这一升温过程的放热峰，该放热峰的外推起始温度即为该溶液的熔融温度T_ph；(2)测定细胞悬液的放热量在溶液形成胞外冰后，细胞悬液从保存液的熔融温度T_ph以5℃/min降温至-50℃，此时热流曲线记录细胞具有渗透活性时的热流变化，再将试样重新加热至保存液的熔融温度T_ph，以200℃/min的速率降温至-150℃，随后重新记录试样从保存液熔融温度T_ph以5℃/min降温至-50℃内的热流曲线；(3)细胞体积的换算将两条热流曲线进行局部积分，曲线交叠部分形成热量差，确定从起始温度冷冻至任意终结温度T时的放热量Δq(T)_dsc及全过程中的放热量Δq_dsc，再结合细胞初始体积V₀及非渗透性体积V_b，代入式(1)中计算细胞降温到任意温度下的体积；V(T)=V0-Δq(T)dscΔqdsc(V0-Vb)---(1)]]>三.确定红细胞的渗透参数：L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]将红细胞在保存液中的体积变化代入水分跨膜转运的数理模型(式(2)、(3))中，运用MatLab软件中的Lsqnonlin函数求解渗透参数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]；Lp=Lpg[cpa]×exp[-ELp[cpa]R(1T-1TR)]---(3)]]>式中V为细胞体积，T为绝对温度，Lp为细胞膜对水的渗透率，L_pg[cpa]为细胞膜在参考温度T_R时对水的渗透率，E_Lp[cpa]为水分渗透过程的表观活化能，R为理想气体常数，A_c为膜上水分输运的有效面积，B为冷冻速度，υ_w为水的偏摩尔体积，V_b为细胞非渗透性体积，n_cpa为细胞内的低温保护剂摩尔数，υ_cpa为低温保护剂的偏摩尔体积，为盐的溶解常数，n_s为细胞内的溶质摩尔数，ΔH_f为水的融化潜热，ρ为纯水密度；四.确定最佳降温速度理论值将细胞的渗透系数L_pg[cpa]及E_Lp[cpa]代入式(2)、(3)中，用Runge-Kutta法模拟细胞在不同降温速度下的胞内水分流失状况；随后按式(4)计算细胞在特定温度t时束缚水含量，按照细胞冷冻到t℃时的束缚水含量未超过5％，认定为细胞对应的最佳降温速度；Wt=Vt-VbV0-Vt---(4)]]>式中V_t为t℃时的细胞体积，W_t为t℃时的细胞束缚水含量。