[发明专利]表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法及其用途

摘要

本发明公开了一种表皮干细胞-修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，采用来源于成体皮肤组织的表皮干细胞与修饰几丁质膜共同培养制备，即对几丁质膜支架材料进行表面修饰改性后与表皮干细胞共同培养，使表皮干细胞在修饰几丁质膜上均匀地、充分铺展并具有良好的生长状态，以利于表皮干细胞在创面中从毛囊干细胞向表皮细胞分化、并产生毛囊等附属器，完成表皮与真皮修复，从而获得理想的创面修复效果，实现病损组织的形态和结构再生、功能重建，用于皮肤组织工程浅层与全层创面修复，对临床创面的修复具有重要意义。

主权项

一种表皮干细胞‑修饰几丁质膜构建仿生皮肤覆盖物的制备方法，其特征在于：采用来源于成体皮肤组织的表皮干细胞与修饰几丁质膜共同培养制备，包括以下步骤：a)表皮干细胞的分离和培养取大鼠或小儿包皮全层皮肤，中性蛋白酶消化过夜，从表皮基底层提取单细胞，洗涤后加入DK‑SFM培养液，移至用Ⅳ型胶原预包被的培养瓶内，37℃下静置10～15min，贴壁细胞即为表皮干细胞；弃去未贴壁的细胞悬液，加入DK‑SFM培养液常规培养，取第2‑3代细胞用于实验；b)采用胶原混合液表面修饰几丁质膜b‑1)胶原混合液的制备在冰上进行如下操作：将无菌10×PBS、无菌蒸馏水、无菌新鲜1NNaOH混合配制平衡液，然后将I型胶原加入所述平衡液混合均匀；其中按照体积比5mg/ml I型胶原∶10×PBS∶1N NaOH＝0.5～1.5∶0.25～0.75∶0.05～0.15，无菌蒸馏水补足总量，混合后I型胶原的终浓度为0.25～3mg/ml；放置15min获得胶原混合液；b‑2)修饰几丁质膜根据模具，几丁质膜裁成呈正方形、且双层十字型放置，在其上加入所述胶原混合液，胶原混合液的添加量为0.2～0.4ml/cm2几丁质膜面积，冰上放置30min～1h，然后放置在37℃孵育箱45min～1h，促进胶体形成；之后在温度‑70～‑80℃下预冷20h或过夜，‑30～‑40℃冷冻真空干燥20～25h；Co60 5～10Kgy辐照，连续3～5次交联并灭菌而获得修饰几丁质膜；c)表皮干细胞‑修饰几丁质膜共培养修饰几丁质膜使用时用培养液平衡后待用；贴壁培养的表皮干细胞消化后制成细胞悬液，细胞密度为1×106～2×106个/ml，表面种植浓缩为0.2～0.5ml细胞悬液，滴加在修饰几丁质膜表面，静置30min～1h后，加入含5～10％胎牛血清的DK‑SFM培养液，于37℃、5％CO2培养箱中，常规培养1～2w，隔天换液，获得表皮干细胞‑修饰几丁质膜仿生皮肤覆盖物。