[发明专利]一种转基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR检测方法

摘要

一种转基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR检测方法，涉及分子生物学领域，该方法根据花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子的保守序列，设计两个特异性外引物和引用农业部953号公告-6-2007公布的CaMV35S启动子检测引物作为内引物，该组引物可检测出不同转基因作物中的花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子，具有广谱性。本发明的检测方法具有高效、灵敏、准确等优点，可避免出现“假阴性”结果，能切实解决转基因作物的检测技术难题。本发明可直接为农业转基因生物安全管理提供技术支持，可对转基因农作物产品的研究、生产、销售进行有效监管，对保障人民健康、环境安全和生物多样性具有重要意义。

主权项

一种转基因作物花椰菜花斑病毒的巢式PCR检测方法，其特征在于，该方法包括：利用Primer Premier V5.0软件进行巢式PCR的引物设计，用Oligo V6.22软件筛选出相互干扰最小的引物；扩增所用的引物及扩增片段大小为：第一轮PCR所用引物引物名称：35S EF 序列（5'→3'）ATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCA          35S ER 序列（5'→3'）TGTGGTGTTTGTGGCTCTGTCCTAA扩增片段大小：454bp；第二轮PCR所用引物引物名称：35S IF 序列（5'→3'）GCTCCTACAAATGCCATCATTGC          35S IR 序列（5'→3'）GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC扩增片段大小：195bp；第一轮PCR反应体系及反应程序为：在PCR反应体系中，加DNA模板2μL（50ng）；反应程序为94℃预变性10min、94℃变性40s、58℃退火40s、72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存；第二轮PCR反应体系及反应程序为：在第二轮PCR反应体系中，加第一轮PCR扩增产物2uL；反应程序为94℃预变性10min、94℃变性40s、56℃退火40s、72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存待测；两轮PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，并样品分析，即可。