[发明专利]猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计

摘要

本发明涉及猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计，属于基因工程疫苗领域。使用生物信息学软件对猪细小病毒(PPV)衣壳蛋白VP2结构建模，经三维结构分析确定VP24个突出的Loop结构所在区；首先在分子模拟和文献支持的基础上，我们推测loop 2，4区可作为外源表位基因插入位点。试验证明，分别缺失PPV VP2 Loop2(212aa～245aa)，Loop4(413aa-424aa)内的相应基因，再用腺病毒表达系统表达，结果Loop2，4缺失突变重组病毒均能装配出规则的病毒样颗粒[PPV：ΔVLPs]。本发明还涉及该重组病毒表达外源基因的重组PPVΔVP2病毒样颗粒在疫苗免疫等方面的应用。

主权项

猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计，其特征在于，1)Loop 2，4缺失的ΔVP2目的基因的克隆根据GenBank中登录号为NC：001718的NADL‑2基因序列为模板，用软件PrimerPremier 5.0设计引物Loop 11，Loop 22，Loop 23，Loop 14，Loop 42和Loop 43，其中Loop 11和Loop 14分别加入酶切位点，引物序列如下：Loop 11：5‑gtc‑gac‑atg‑agt‑gaa‑aat‑gtg‑gaa‑caa‑c‑3 sal ILoop 22：5‑tgg‑att‑tag‑gtt‑tct‑gat‑g‑3Loop 23：5‑cat‑cag‑aaa‑cct‑aaa‑tcc‑aga‑ctc‑aat‑aca‑aac‑agg‑act‑3Loop 14：5‑gcc‑ctc‑gag‑cta‑gta‑taa‑ttt‑tct‑tgg‑3xhoILoop 42：5‑ttg‑ttg‑ctt‑tgg‑agc‑tct‑tcc‑3Loop 43：5‑gga‑aga‑gct‑cca‑aag‑caa‑caa‑ctt‑tta‑cct‑tca‑gat‑cc‑3通过SOE法基因拼接：以质粒pT VP2为模板，以引物Loop 11，Loop 22进行PCR扩增VP2片段660bp，产物在质量比1％琼脂糖凝胶上电泳后回收；以引物Loop 23，Loop 14进行PCR扩增VP2片段1047bp，产物在1％琼脂糖凝胶上电泳后回收；再以上述2个回收产物为模板，引物Loop 11，Loop 14PCR扩增VP2Loop2缺失片段；分别以引物Loop 11，Loop 42和引物Loop 43，Loop 14扩增VP2片段1227bp和465bp，并分别回收作模板，再以引物Loop 11，Loop 14PCR扩增VP2Loop 4缺失片段；将VP2 Loop 2缺失片段和VP2Loop 4缺失片段分别与pMD19‑T Vector连接，转化E.coliDH5α，碱裂解法提取质粒，分别用sal I和xho I双酶切鉴定，获得阳性质粒pTΔVP2‑2和pTΔVP2‑4，并测序；2)重组质粒pShuttle‑ΔVP2‑2，pShuttle‑ΔVP2‑4的构建与鉴定利用双酶切位点sal I和xho I分别将pTΔVP2‑2和pTΔVP2‑4克隆至转移载体pShuttle‑CMV中；用PCR、sal I和xho I双酶切及测序分析进行鉴定，分别命名为重组质粒pShuttle‑ΔVP2‑2，pShuttle‑ΔVP2‑4；3)重组PPVΔVP2‑2，PPVΔVP2‑4病毒样颗粒的获得用Pme I分别酶切重组质粒pShuttle‑ΔVP2‑2和pShuttle‑ΔVP2‑4，使其线性化，然后与骨架载体pAdEasy TMVector在1.8kV、25μF和200Ω条件下电转化至大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使pShuttle‑ΔVP2‑2和pShuttle‑ΔVP2‑4rShuttle‑ΔVP2‑2pAdEasyTM Vector发生同源重组，转化至DH5α宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCR、PacI酶切鉴定重组是否正确，构建成重组质粒，分别命名为pAd‑ΔVP2‑2和pAd‑ΔVP2‑4；4)将重组质粒pAd‑ΔVP2‑2和pAd‑ΔVP2‑4转染HEK‑293A细胞，获得重组病毒rAd‑ΔVP2‑2和rAd‑ΔVP2‑4；重组腺病毒表达蛋白在HEK‑293A细胞中自我装配成病毒样颗粒PPV：ΔVLPs，即为获得的Loop 2，4基因缺失的重组PPVVP2病毒样颗粒。