[发明专利]一种检测转绿色荧光蛋白基因及启动子的PCR方法

摘要

本发明提供了一种检测转基因羊转绿色荧光蛋白基因及启动子的PCR方法，针对转基因羊，依据GFP基因序列和pLEX载体CMV启动子序列，设计的两对特异性引物：分别为GFP-上游引物：TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC；GFP-下游引物:AGGACCATGTGATCGCGCTTCT;CMV-上游引物：TCCCATAGTAACGCCAATAG;CMV-下游引物:GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA；以转基因羊基因组DNA为模板，扩增GFP基因，其片段为595bp；扩增CMV基因，其片段为421bp。本发明将单一的PCR方法设计为双重的PCR方法，可一次检测两种基因结构有独到之处，具有重要的实用价值。

主权项

一种检测转基因羊绿色荧光蛋白基因及启动子的PCR方法，其特征在于：针对转基因羊，依据GFP基因序列和pLEX载体CMV启动子序列，设计两对特异性引物，其一为GFP‑上游引物： TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC；GFP‑下游引物: AGGACCATGTGATCGCGCTTCT;其二为CMV‑上游引物：TCCCATAGTAACGCCAATAG;CMV‑下游引物：GCTTATATAGACCTCCCACCGTACA；以转基因羊基因组DNA为模板，扩增的GFP基因的片段为595bp；扩增的CMV基因的片段为421bp；其中DNA模板的提取：1）取羊脐带组织的碎块100µg，依次加入0.5mL的裂解液；10mmol/LTris‑Cl，pH7.5；1mmol/L EDTA，pH7.5；0.1％（m/V）SDS；消化前加入100mg/mLRNA酶15µl、10mg/mL蛋白酶K 15µl，不停地摇动，在55℃下消化58‑63分钟待用；其中裂解液的配方：取10mmol/L Tris‑Cl，pH7.5；1mmol/L EDTA，pH7.5；0.1％（m/V）SDS；100mg/mLRNA酶；10mg/mL蛋白酶K，置于试剂瓶中混合均匀即可；2）取上步消化物，加入0.5mL的酚、氯仿、异戊醇的混合液，其混合比为25:24:1，混合均匀后置于室温下静置4‑5分钟，12000转/分钟、离心8‑10分钟，取上清液，用0.5mL氯仿抽提一次，室温下静置5‑6分钟，12000转/分钟、离心10‑12分钟待用；3）取上步上清液加入两倍体积的无水乙醇，室温静置7‑10分钟,沉淀DNA； 经12000转/分钟、离心9‑11分钟，用1mL 70％乙醇洗涤1次；12000转/分钟、离心1.5‑2.0分钟，弃上清，室温静置干燥7‑12分钟；加入50µl TE，即为10mmol/L Tris‑Cl, pH7.4；1 mmol/L EDTA，pH 8.0；溶解DNA，4℃贮存备用；其中PCR反应体系：50µl反应体系为:10×PCR Taq Buffer 5µl ;25mM MgCl2                     4µl ;dNTP Mix(2.5mM each ) 5µl ; 引物(10pM/µl)各 0.5µl; DNA模板 100µg/mL 6µl ;Taq DNA Polymerse 1.25µl ; Nuclease‑free Water  26.75µl;总体积为50µl；其中 PCR反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；其中琼脂糖凝胶电泳检测：PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳，电压80V，电泳结束、凝胶成像，在595bp和421bp处出现清晰条带。