[发明专利]七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子

摘要

本发明提供的七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子，根据GeneBank中绵羊BMPR-1B基因(NM_001009431.1序列)；用shRNA设计软件设计干扰BMPR-1B基因转录的shRNA分子群,从设计的34条shRNA分子中，根据结构和位置筛选出8条针对不同位点的shRNA序列进行合成；将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒（pLL-BMPR-1B-shRNA），将干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒，经荧光PCR及Westernblot检测表达，获得了7个显著抑制BMPR-1B基因的shRNA分子，在mRNA水平上抑制效率达90%以上，对BMPR-1B蛋白的抑制达80%以上。

主权项

1.七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子，其特征在于：依据GeneBank中绵羊BMPR-1B基因，即NM-001009431.1序列；设计34条shRNA分子，针对不同位点的shRNA序列进行合成，将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒，将pLL-BMPR-1B-shRNA干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒，经荧光PCR及Westernblot的检测，确定7个显著抑制BMPR-1B基因表达的shRNA分子；其中使用的引物：①LV-BMPR-1B-749Sense:5’TGGACAATAGCAAAGCAAATTTCAAGAGAATTTGCTTTGCTATTGTCCTTTTTTC-3’(55bp)；Antisense:5’TCGAGAAAAAAGGACAATAGCAAAGCAAATTCTCTTGAAATTTGCTTTGCTATTGTCCA-3’(59bp)；②LV-BMPR-1B-803Sense:5’TGTAGATGTTTCAAGGTATATTCAAGAGATATACCTTGAAACATCTACTTTTTTC-3’(55bp)；Antisense:5’TCGAGAAAAAAGTAGATGTTTCAAGGTATATCTCTTGAATATACCTTGAAACATCTACA-3’(59bp)；③LV-BMPR-1B-1306Sense:5’TGATGAGAGCTTGAACAGAATTCAAGAGATTCTGTTCAAGCTCTCATCTTTTTTC；-3’(55bp)；Antisense:5’TCGAGAAAAAAGATGAGAGCTTGAACAGAATCTCTTGAATTCTGTTCAAGCTCTCATCA-3’(59bp)；④LV-BMPR-1B-1475Sense:5’TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC-3’(59bp)；Antisense:5’TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCAA-3’(59bp)；⑤LV-BMPR-1B-1685Sense:5’TGGACAAAGCCAGTAGATATTTCAAGAGAATATCTACTGGCTTTGTCCTTTTTTC-3’(59bp)；Antisense:5’TCGAGAAAAAAGGACAAAGCCAGTAGATATTCTCTTGAAATATCTACTGGCTTTGTCCA-3’(59bp)；⑥LV-BMPR-1B-2567Sense:5’TGTAAGAAGATGGTGTCAAATTCAAGAGATTTGACACCATCTTCTTACTTTTTTC-3’(59bp)；Antisense:5’TCGAGAAAAAAGTAAGAAGATGGTGTCAAATCTCTTGAATTTGACACCATCTTCTTACA-3’(59bp)；⑦LV-BMPR-1B-2745Sense:5’TGAGGAAACGTATCAGGTTATTCAAGAGATAACCTGATACGTTTCCTCTTTTTTC-3’(59bp)；Antisense:5’TCGAGAAAAAAGAGGAAACGTATCAGGTTATCTCTTGAATAACCTGATACGTTTCCTCA-3’(59bp)；其中shRNA分子的获取1）shRNA慢病毒载体的构建各取10UL10uM的两条siRNA寡核苷酸，即为正链和互补链；加入8μL10×annealingbuffer和12μL灭菌超纯水，煮沸10分钟后冷却至室温；同时用pLL3.7质粒载体经XhoI和HpaI双酶切后回收质粒，与退火产物4℃过夜连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，即用LB平板氨苄青霉素100ug/uL；用载体检测引物及shRNA寡核苷酸引物筛选阳性克隆，并送上海生工所测序鉴定，提取纯化重组质粒用于转染；2）plex-bmpr-1b、Lv-BMPR-1B-shRNA慢病毒的制备铺板，每10cm面积中铺5×10⁶个293T细胞；Lipectamine2000脂质体转染，在含有脂质体和DNA复合物的试管中加入1.5ml预热的OPTI-MEMＩ培养基，加入目的载体及病毒包装载体，其载体的加量分别为：转染载体lv-bmpr-1b-shRNA12ug、REV6ug、pMDL6ug、VSVG6ug；plex-bmpr-1b12ug、Pspax₂9ug、PMD2.G3.5ug，轻轻混匀，室温放置5分钟，之后将上述稀释好的DNA与脂质体混合，置于室温孵育20分钟，此时用OPTI-MEMＩ培养基清洗液转染细胞一次；将脂质和DNA复合物加入细胞，置于37℃培养箱，培养4-6小时，换10mL新鲜的DMEM完全培养基，继续培养48-50小时，收集病毒,此时的病毒直接用于转染或置于-70℃备用；3）重组Lentivirus感染的Hek293细胞系将滤过的重组0.5mLLentivirus和0.5mL培养液，以体积比1：1混合，加入浓度为10μg/mL的聚凝胺1μL,将病毒加入细胞，置于32℃培养箱14-16h，移回37℃培养箱孵育4-6h，更换新鲜培养液，在37℃培养箱继续培养，感染48-52h，将6孔培养皿中的细胞转入100mm培养皿中，1-1.5h加入含有浓度为600ng/mL的Puromycin的选择性培养液；每隔2-3天更换选择性培养液，2-3周获得稳定转染的细胞；4）shRNA病毒载体感染含BMPR-1B的Hek293细胞系感染前按每孔4×10⁵个/mL的密度将表达BMPR-1B的Hek293细胞接种于六孔板,用2mL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，24-26h备用；将500μL的shRNA干扰病毒与500μL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，以体积比1：1混合，同时加入1μL10μg/mL的Polybrene,24-30h，更换含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液，再培养24-28h收获细胞；用Trizol法提取总RNA及细胞蛋白裂解液提取蛋白；5）siRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价PCR反应体系：2хmastermix10μL,上下游（10pm）个0.8μL；cDNA2μL；PCR反应条件：95℃10s,58℃20s,72℃20s,55个循环后进入溶解曲线分析程序：40℃-99℃，即为0.1℃/s；通过定量分析得出：pSi749能够有效抑制68.3%的BMPR-1B的转录，pSi803能够有效抑制71.2%的BMPR-1B的转录，pSi1306能够有效抑制99.86%的BMPR-1B的转录，pSi1475能够有效抑制99.78%的BMPR-1B的转录，pSi1685能够有效抑制96.42%的BMPR-1B的转录，pSi2567能够有效抑制94.37%的BMPR-1Bp的转录，Si2745能够有效抑制80.5%的BMPR-1B的转录；其中细胞蛋白裂解液：由50mMTris，pH7.4，150mMNaCl,1%NP-40,0.1%SDS配制，混合均匀后使用。