[发明专利]一种快速鉴别天花粉类药材的分子生物学方法

摘要

本发明涉及一种鉴别天花粉及其类似品的分子鉴别新方法，在引物设计和退火温度2个关键的环节上实现了大胆的创新。引物设计在天花粉类药材已知的ITS上进行，长度为20bp左右，遵循一般引物的设计原则。同时，退火温度也根据多态性条带的多少进行筛选确定。天花粉的特征鉴别条带确定为560，960bp条带，1930，1400，839，715bp等条带可作为天花粉的辅助鉴别带。该发明具有如下优点：①简单易行。虽然在引物设计上稍增加了难度，但其特异性大大增加，设计2～3个引物即可得到理想的鉴别引物，避免了大量筛选随机引物的烦恼；②稳定性和重复性好。由于提高了引物的特异性和退火温度，扩增条带一般只有1～5条，正品不同产地和不同储存时间对PCR结果均没有影响；③提供的信息量大。能对正品及大部分伪品同时进行扩增，从而可以分别建立正品及伪品的标准电泳鉴别图谱以实现对正、伪品的准确鉴别。

主权项

一种鉴别天花粉及其类似品的分子鉴别新方法，是根据天花粉核糖体RNA基因中ITS序列设计3个单引物，其PCR反应体系为25μL，其中Tris‑HCI(pH 9．0)10mmol·L‑1，KC1 50mmol·L‑1，Mg2+1.5 mmol·L‑1，dNTP各 0.15 mmol·L‑1，Taq 1U(promega)，Primer 0.15 μmol·L‑1，模板 DNA 50 ng，扩增在 ABI9700上进行，扩增程序为95℃预变性 4 min，接着进行 40个循环：95℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸60s，循环结束后72℃延伸5min。