[发明专利]一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法

摘要

本发明公开了一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，通过制备DHA产生菌双鞭甲藻（Crypthecodinium.cohniiATCC30556）的原生质体，并对其进行紫外+LiCl、硫酸二乙酯的单一或复合诱变，同时结合代谢调控发酵育种的基本思路，采用含丙二酸和/或高糖的抗性平板进行定向筛选，并以红四氮唑（TTC）的固体培养基进行初筛，有效提高筛选效率，减少筛选环节和工作量。初筛获得的菌株经摇瓶复筛和遗传稳定性验证，发现诱变后菌株生长活性提高，与出发菌株相比，YVD-4诱变株的DHA生物合成量提高了4.7倍，达到45.3g/L，具备优异的工业化生产前景。

主权项

一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，其步骤如下：（1）种子的培养将双鞭甲藻（Crypthecodinium. cohniiATCC30556）接种于种子培养基中，接种量体积百分比为5~10%，培养温度为26~30℃，摇床转速160~200r/min，培养24~48h至对数期；（2）种子液的预处理取步骤1培养至对数期的细胞，4000 r/min转速下离心5~10min，0.2mol/L磷酸盐缓冲液洗涤2~3次，稀释40~80倍后，经无菌玻璃珠打散，6 层无菌纱布过滤得单细胞悬浮液；（3）原生质体的制备及紫外诱变处理将适量的原生质体化反应液，即步骤2单细胞悬浮液、酶液及渗透压调节剂按1：1~4：20~35比例组成的混合液，在25~30℃条件下处理20~30 min；酶解液过滤，离心分离，洗涤并稀释至106个/mL，得原生质体纯化液；该原生质体纯化液先以0.8% LiCl进行预处理，然后置于有磁力搅拌棒的无菌培养皿中，菌液厚度不超过2mm，加盖，开紫外灯预热20min，在15W~30W紫外灯下，距离30cm处的磁力搅拌器上，放置培养皿，缓慢搅拌，打开皿盖进行紫外照射5~30 min，取出培养皿，梯度稀释，整个过程在红光下操作；26~30℃培养4~7d；（4）硫酸二乙酯诱变处理取步骤3得到的原生质体纯化液加体积百分数为10%的硫酸二乙酯，于160~200r/min振荡混合处理5~10min，加入1mL 25%的硫代硫酸钠终止反应；将反应液稀释500~1000倍并于添加了氧化还原剂红四氮唑（TTC）的固体培养基上，26~30℃培养4~7d；（5）耐丙二酸和高糖菌株的筛选挑选TTC活性最强，即生长速度较快，染色较深、较大的菌落作为初筛获得的菌株，这些菌株DHA的积累量相对较多，将这些正变株重新活化后，制备单细胞悬液，并分别涂布于含0.05%丙二酸平板和/或高糖平板培养基上26~30℃培养4~7d；（6）摇瓶复筛将上述抗性平板上生长较快、较大的菌落接种于种子培养基中进行传代培养，然后分别进行摇瓶发酵，在发酵培养基中，26~30℃培养3~5d；测定发酵液中菌体的脂肪酸含量和DHA含量，并以此作为筛选指标，获得较高产量的正变株。