[发明专利]蜂蜜基因的提取方法

摘要

蜂蜜基因的提取方法，涉及生物化学领域。本发明方法采用了10毫升以上的蜂蜜进行提取，又采用磷酸盐缓冲溶液去除蜂蜜中的可溶性多糖，利用裂解缓冲液使蜂蜜中的植物成分细胞裂解，同时用高浓度的氯化钠溶液除去大部分糖蛋白，减少纯化时糖蛋白对DNA的干扰。用苯酚、氯仿、异戊醇混合溶液进一步除去蛋白，最后用异丙醇在低温条件下使DNA沉淀，获得纯化的蜂蜜DNA。本发明方法结果稳定，重现性好，且操作简单、费用低、无需特殊仪器和试剂，所得蜂蜜DNA质量较好，能满足聚合酶链式反应的要求，可实现蜂蜜品质的快速鉴定。本发明方法可开发蜂蜜基因提取试剂盒，提取获得的蜂蜜DNA可作为试剂应用于蜂蜜来源的快速鉴定中。

主权项

一种蜂蜜基因的提取方法，其特征在于按以下步骤顺序进行：（1）取10 mL以上蜂蜜，加入等体积的pH为7.0~8.0的磷酸盐缓冲溶液，振荡1~3小时，充分混匀后离心，弃去上清液，加入3 mL pH为7.0~8.0的磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀，离心，弃去上清液，保留沉淀物；（2）加入1 mL裂解缓冲液于沉淀物中，充分悬浮，混匀，加入10 μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液，混匀，置65 ℃水浴加热45~60 min，不时摇动；所述的裂解缓冲液是十六烷基三甲基溴化铵、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸和氯化钠的混合水溶液，其中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为50mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为2mmol/L，氯化钠的浓度为400mmol/L，用盐酸调pH至8.0；（3）取出，加入300 μl饱和氯化钠溶液，剧烈振荡2分钟，置于0 ℃下放置3~5 min，离心；（4）取上清液，加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1的混合溶液，混匀，离心；（5）取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇体积比为24:1的混合溶液，混匀，离心；（6）取上清液，加入十分之一体积的3 mol/L醋酸钠溶液，混匀，加入与混合液等体积的异丙醇，混匀，在‑20 ℃放置2小时，离心，弃去上清液，保留沉淀物；（7）取沉淀物用75~80%乙醇洗涤后，室温下将乙醇吹干，将沉淀在室温下干燥得蜂蜜DNA干品或将沉淀溶于pH8.0的TE溶液中，即得蜂蜜DNA试剂；所说的TE溶液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为1mmol/L，其余为水。