[发明专利]一种重组E.coli Klenow酶的纯化方法

摘要

本发明提供了一种重组E.coli Klenow酶的纯化方法，由以下步骤组成：1)破菌、2)两步盐析、3)金属螯合亲和层析和4)凝胶过滤层析。此方法具有工艺简便、快速，获得的Klenow酶质量高、成本低的特点，十分适合工业放大生产。

主权项

一种重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于：由以下步骤组成：1)破菌表达重组E.coli Klenow片段的菌体，以1∶5～20的比例加入破菌缓冲液，搅拌10～20min使之混合均匀，在4～10℃下破碎菌体10～20min，再将得到的破菌液在10000～20000g下离心10～20min，温度控制在0～10℃，取其上清液；破菌缓冲液为20～50mM Tris‑HCl，PH7.5～8.5、0.1～5mMEDTA、0.5～1M NaCl、溶菌酶0.5～2mg/ml、加入PMSF至0.02～1mM；2)两步盐析第一步盐析的饱和度为40～50％：先将硫酸铵盐用研钵研碎，向破菌上清液中缓慢加入，及时搅拌，加入比例为100ml破菌上清液加入22.6～29.1g硫酸铵，沉淀温度控制在0～10℃，时间大于2h，然后在10000～20000g下离心10～20min，离心温度控制在0～10℃，留取上清；第二步盐析的饱和度为80～85％：先将硫酸铵盐用研钵研碎，向一级盐析上清中一次性加入，搅拌至完全溶解，加入比例为100ml破菌上清液加入51.6～55.9g硫酸铵，沉淀温度为0～10℃，时间大于2h，然后在10000～20000×g下离心10～20min，温度为0～10℃；3)金属螯合亲和层析金属螯合层析柱高为2.5～15cm，用缓冲液I平衡色谱柱3～5CV，上样量为每ml填料上样菌体蛋白100～300mg，上样线性流速 为30～120cm/h，洗脱线性流速为100～300cm/h，上样后冲洗5～10CV，UV280洗至基线，缓冲液II洗脱杂蛋白5～10CV，UV280洗至基线，缓冲液III洗脱目的蛋白，收集UV280大于100mAu组分；缓冲液I为20～50mM Tris‑HCl，pH7.5～8.5、0.5～1M NaCl、5～10mM咪唑；缓冲液II为20～50mM Tris‑HCl，PH7.5～8.5、0.5～1MNaCl、40～60mM咪唑；缓冲液III为20～50mM Tris‑HCl，PH7.5～8.5、0.5～1M NaCl、250～350mM咪唑。色谱过程中温度维持在4～10℃；4)凝胶过滤层析凝胶柱高度为50～70cm，上样量为1％～5％，色谱过程中温度维持在4～10℃，上样流速10～30cm/h，洗脱流速20～60cm/h，收集UV280大于150mAu样品；