[发明专利]一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法

摘要

本发明公开了一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法。包括利用萃取裂解缓冲液和染色缓冲液进行单细胞悬浮液制备；采用德国partec公司生产的CyFlow®Cube型号的流式细胞仪测定样品DNA荧光强度进行倍性分析；对比待测样品与对照的DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，即可鉴定出待测样品的倍性水平。流式细胞仪倍性鉴定结果与根尖染色体计数倍性鉴别结果相一致。应用此法，可快速筛选鉴定出批量的非洲菊大孢子再生植株倍性，大大提高DH群体构建和遗传图谱绘制的效率，从而加速了育种进程。本发明制样简单、检测快速、具有稳定的高检出率。

主权项

1.一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法，包括以下步骤：（1）样品前处理制剂的制备：样品前处理制剂由萃取裂解缓冲液和染色缓冲液组成，染色缓冲液需现配现用；所述的萃取裂解缓冲液的配制：用蒸馏水配制pH为3，终浓度为2%质量分数的聚乙烯毗咯烷酮K30，100mM的一水柠檬酸，0.5%体积比的Tween20的混合缓冲液，贮藏于4℃保存；所述的染色缓冲液的配制：1mg4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐溶于浓度为400mM的Na₂PO₄·12H₂O缓冲液500mL中，用蒸馏水配制，pH为9；（2）单细胞悬浮液的制备：切取0.2～0.5m²洁净的非洲菊大孢子再生试管苗幼叶置于平底培养皿中，加步骤（1）所述的萃取裂解缓冲液400μl，用刀片从纵横两个垂直方向快速将小叶片切碎，并使碎片完全浸于萃取液中，避光静置萃取2～5min，后再加步骤（1）所述现配制的染色缓冲液1600μl混匀，避光静置染色5～8min，30μm滤网过滤，滤液收集于流式细胞仪机用标准样品管，所收集的滤液即为单细胞悬浮液；（3）对照及待测样品的流式细胞术倍体水平鉴定设置已知倍性的非洲菊试管苗为对照材料，将对照样品单细胞悬浮液置于德国partec公司生产的CyFlowCube型号流式细胞仪测定，流式细胞仪激发光源为20mW、488nm的蓝宝石固体激光；测定前流式细胞仪自动清洗内部使管道畅通，喷嘴清洁；控制样品进样速度为0.1至20微升/秒，各通道的变异系数CV稳定且在0～3％，手动控制细胞流速在100～120个/秒以保持细胞分离纯度；通过与CyFlowCube型号流式细胞仪相连的PartecCyView85计算机分析软件，调整电压设置对照DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，即可进行待测样品的倍性鉴定；同对照相同的测试条件下，对比待测样品与对照产生的DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，即可鉴定出待测样品的倍性水平，具体是：①以已知的二倍体非洲菊试管苗为对照时，设置对照样品DNA含量荧光强度分离峰在横坐标100的位置，当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标100±5%的位置时，该待测样品为二倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标50±5%的位置时，该待测样品为单倍体；当待测样品的DNA含量直方图出现两个以上分离峰，且最高分离峰和最矮分离峰的高度相差不超过一半的为混倍体，混倍体的倍性组成由各分离峰所在横坐标的位置确定；②以已知的非洲菊大孢子再生单倍体植株试管苗为对照时，将对照样品DNA含量荧光强度分离峰设置在横坐标50的位置，当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标50±5%的位置时，该待测样品为单倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标100±5%的位置时，该待测样品为双单倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标200±5%的位置时，该待测样品为四倍体；当待测样品的DNA含量直方图出现两个以上分离峰，且最高分离峰和最矮分离峰的高度相差不超过一半的为混倍体，混倍体的倍性组成由各分离峰所在横坐标的位置确定。